Plasma Plasmodium falciparum Protéine riche en histidine – Les concentrations ne reflètent pas la gravité du paludisme chez les enfants de Papouasie-Nouvelle-Guinée

Contexte Dans les zones de transmission instable du paludisme, les concentrations plasmatiques plasmatiques de Plasmodium falciparum riches en histidine PfHRP- sont parallèles à la biomasse parasitaire totale et donc à la gravité de l’infection Cependant, lorsque la transmission est plus intense, la PfHRP plasmatique peut ne pas prédire les complications et la mortalité. Nous avons recruté des enfants âgés de plusieurs mois atteints de paludisme grave à P. falciparum, avec un paludisme non compliqué, et des témoins sains. Les groupes ont été appariés selon l’âge, le sexe et la province de naissance parentale. Plasma PfHRP- niveaux ont été quantifiés par des tests immunologiques validés Résultats Des concentrations plasmatiques de PfHRP détectables étaient présentes chez des témoins sains% Bien que les concentrations plasmatiques de PfHRP étaient plus élevées chez les enfants atteints de paludisme clinique P & lt; , il n’y avait pas de différence entre ceux avec des infections médianes non compliquées et graves, et ng / mL, respectivement [intervalle interquartile, – et – ng / mL, respectivement]; P = Logarithmie, hémoglobine, bilirubine plasmatique logarithmique et créatinine plasmatique étaient indépendamment associés aux concentrations plasmatiques de PfHRP dans les analyses de régression multiple P ≤, mais le coma, le taux de lactate dans le sang et le taux de bicarbonate plasmatique n’étaient pas significatifs. une concentration plasmatique de PfHRP de ng / mL, proche du groupe médianConclusions L’utilité clinique et pronostique des concentrations plasmatiques de PfHRP dépend des circonstances épidémiologiques. Dans les zones de transmission intense du paludisme, la PfHRP plasmatique reflète les infections récentes et présentes.

La protéine riche en histidine de Plasmodium falciparum – PfHRP – est une protéine hydrosoluble qui est synthétisée par les stades sexuels asexués et précoces du parasite. Sa production augmente à mesure que le parasite asexué mûrit de telle sorte que la plus grande partie est libérée à la schizogonie. – peut être non lié dans le plasma, lié aux anticorps dans le plasma, dans les érythrocytes infectés, lié aux érythrocytes non infectés dans le cadre de complexes immuns, et / ou lié à d’autres cellules telles que les leucocytes Sa présence dans le plasma a permis le développement de points peu coûteux tests rapides de détection des TDR Ceux-ci jouent un rôle diagnostique primaire là où la microscopie fiable n’est pas disponible ou dans des situations où les densités des jeunes formes circulantes non-cytoadhérentes sont inférieures à celles détectables par microscopie, comme dans les infections hautement synchrones [ ] ou la grossesse PfHRP- peut être quantifiée plus précisément dans le plasma en utilisant des techniques conventionnelles, y compris ELISA enzyme-linked immunosorbent assay [,,] Bec Les concentrations plasmatiques de PfHRP ont été suggérées en tant que marqueur cliniquement utile de la biomasse séquestrée de parasites matures cytoadhérents et donc de la présence de complications telles que le coma et l’insuffisance rénale dans les études sur les adultes asiatiques. , les concentrations plasmatiques de PfHRP à la présentation ont été associées à un paludisme grave à P. falciparum et à une mortalité subséquente Cependant, dans une autre étude relativement petite impliquant des enfants africains, aucune association n’a été trouvée . le marqueur de la gravité et de l’issue peut dépendre du contexte épidémiologique PfHRP- peut être détecté dans le sang jusqu’à plusieurs semaines après un traitement réussi du paludisme à P. falciparum, y compris chez les enfants Dans les zones de transmission instable sans ou avec immunité limitée au paludisme, chez les adultes sans infection récente et présentant une présentation symptomatique relativement précoce, les concentrations plasmatiques de PfHRP à l’admission peuvent être parallèles Cependant, chez les enfants provenant de zones de transmission hyperendémique qui sont susceptibles d’avoir connu de récentes infections asymptomatiques ou symptomatiques, qui ont un certain degré d’immunité, y compris pour la PfHRP elle-même , et qui peuvent ainsi se présenter relativement tard, la PfHRP plasmatique quantifiée par immunodosage peut ne pas identifier de manière fiable les personnes ayant des infections sévères et celles à risque de mort Nous avons donc émis l’hypothèse que les concentrations plasmatiques de PfHRP chez les enfants mélanésiens d’une région hyperendémique de Papouasie. La Guinée PNG ne distinguerait pas de manière fiable ceux qui ne présentent pas de complications de ceux atteints de paludisme grave à P. falciparum

PATIENTS ET MÉTHODES

Site d’étude et participants

La province de Madang sur la côte nord de la Papouasie-Nouvelle-Guinée a une population estimée à ~ ,,% de & lt; La transmission de Plasmodium falciparum et P vivax est holoendémique avec un taux d’inoculation entomologique estimé de piqûres infectieuses par an L’hôpital Modilon est l’hôpital provincial et l’établissement de soins de santé auxquels sont confiés la majorité des enfants gravement malades. Les enfants atteints de paludisme grave dans la sous-étude actuelle comprenaient tous ceux âgés de plusieurs mois à quelques années admis à l’hôpital Modilon entre octobre et août pour lesquels le plasma congelé était disponible. Les contrôles sains des enfants sans maladie aiguë ou antécédents de paludisme dans les semaines précédentes ont été recrutés. Les enfants atteints de paludisme non compliqué ont été recrutés dans les cliniques de vaccination, à la clinique ambulatoire pédiatrique de l’hôpital Modilon et au centre de santé d’Alexishafen, à proximité, et ont également été jumelés à des cliniques de vaccination. avec les cas graves selon l’âge, le sexe et la prov Les cas de paludisme grave ont été sélectionnés pour être d’un âge qui était dans les mois de l’indice. Cas grave de paludisme Le consentement éclairé écrit a été obtenu du parent / tuteur La présente étude a été approuvée par l’Institut de recherche médicale de PNG. Institutional Review Board et le Comité consultatif de la recherche médicale du Département de la santé de la PNG et mené conformément à la Déclaration d’Helsinki

Évaluation clinique et gestion

Après le recrutement, un formulaire de déclaration standardisé comprenant des informations démographiques, des antécédents médicaux et des détails sur la maladie actuelle a été rempli. Sang veineux prélevé pour la préparation de frottis sanguins colorés au Giemsa, test rapide sur les antigènes. Le taux de lactate dans le sang HemoCue a été mesuré enzymatiquement en utilisant Lactate Pro Arkray Le plasma restant a été conservé à – ° C pour un dosage ultérieur. Des hémocultures ont été réalisées dans le cadre de l’évaluation standard. pour exclure une bactériémie concomitante Les ponctions lombaires ont été réalisées en cas de suspicion clinique de méningite bactérienne, conformément aux protocoles de prise en charge nationaux Les enfants ont été classés comme ayant un paludisme grave s’ils avaient eu & gt; formes asexuées de P falciparum par microlitre de sang total en présence de ou plus de ce qui suit: troubles de la conscience ou coma Blantyre Coma Score of & lt; , prostration une incapacité à s’asseoir ou se tenir sans aide, de multiples saisies, hyperlactatemia niveau de lactate dans le sang de & gt; mmol / L, niveau d’hémoglobine d’anémie sévère de & lt; g / L, urine foncée, niveau de glycémie hypoglycémique de & lt; mmol / L, ictère ou détresse respiratoire Ces critères sont conformes à la définition de l’Organisation mondiale de la santé Les enfants gravement malades chez qui P vivax a été identifié par PCR en chaîne avec ou sans P falciparum ont été exclus Enfants ayant une densité de P falciparum de & gt; Les témoins sains ne présentaient aucun antécédent récent ou récent de paludisme, indépendamment de la présence ou de l’absence de P falciparum en microscopie. Un traitement antipaludéen était administré et les complications étaient gérées par le personnel hospitalier selon les normes nationales. protocoles

Méthodes de laboratoire

La parasitémie à P. falciparum a été déterminée en comptant le nombre de parasites par leucocytes et un nombre supposé de globules blancs de cellules / μL Les espèces de Plasmodium ont été confirmées par PCR Tests biochimiques incluant la bilirubine plasmatique, l’alanine aminotransférase et la créatinine ont été effectuées sur du plasma congelé stocké en utilisant un analyseur Cobas Integra Roche Diagnostics Des procédures de microbiologie diagnostique, y compris la culture de sang et l’analyse du liquide céphalo-rachidien ont été signalés ailleurs

PfHRP- Assay

Le niveau de PfHRP a été quantifié dans du plasma en utilisant un kit de test d’antigène du paludisme disponible dans le commerce incorporant un ELISA Celisa; Cellules Les recommandations du fabricant ont été suivies de modifications mineures Les échantillons ont été lus par spectrophotométrie à une longueur d’onde de nm et la densité optique a été corrigée en soustrayant les valeurs à blanc. Concentration connue r ≥ vs densité optique à nm, ébauches de diluant tamponné phosphate-tampon Tween et au moins trois dilutions d’échantillons de plasma Une limite inférieure de détection a été estimée en dosant le plasma d’adultes caucasiens expatriés et de cliniciens mélanésiens n’ayant jamais eu de paludisme. La densité optique moyenne plus les écarts-types pour ces échantillons correspondaient à une concentration PfHRP de ng / mL, qui était sur la partie linéaire de la courbe étalon Valeurs de & lt; ng / mL ont été considérés comme négatifs Lorsque les patients présentant des signes cliniques et microscopiques de paludisme avaient des concentrations plasmatiques de PfHRP de & lt; ng / mL, le test a été répété Le coefficient de variation inter-essai était de%

Analyses statistiques

Le package logiciel SPSS pour Windows version; SPSS a été utilisé pour l’analyse statistique Les données sont présentées en proportions, moyenne ± SD, moyenne géométrique SD, ou, dans le cas des variables non conformes à une distribution normale ou log-normale, intervalle interquartile médian [IQR] Comparaisons de variables entre les groupes étaient par des tests paramétriques ou non paramétriques selon le cas. L’analyse multivariée était par régression linéaire progressive par étapes avec choix de variables indépendantes basées sur la plausibilité biologique et / ou P & lt; sur l’analyse de régression bivariée Niveau de significativité de P & lt; a été utilisé tout au long

RÉSULTATS

Caractéristiques du sujet

Nous avons recruté des témoins sains, des enfants atteints de paludisme non compliqué et des enfants atteints de paludisme grave. Les caractéristiques cliniques et de laboratoire des sujets de ces trois groupes sont résumées dans le tableau. Il n’y avait pas de différences significatives entre les groupes d’âge, de sexe ou de poids. Le taux respiratoire était plus élevé chez les enfants atteints de paludisme grave que chez les enfants atteints de paludisme non compliqué. La fréquence respiratoire était plus élevée chez les enfants atteints de paludisme grave que chez les enfants atteints de paludisme non compliqué. Une bactériémie concomitante ou une méningite bactérienne aiguë n’a été identifiée chez aucun enfant atteint de paludisme grave

Tableau Caractéristiques démographiques, anthropométriques, cliniques et de laboratoire des enfants dans les groupes Caractéristique Contrôles sains n = paludisme non compliqué n = paludisme grave n = P Âge, mois – – – sexe masculin, non% poids corporel, kg – – – température axillaire, ° C – – – & lt; Taux respiratoire, respirations / min – – – & lt; Blantyre Coma Score, no% & lt; – & lt; ≤ & lt; Convulsions multiples, non% & lt; La rate palpable, non% & lt; Densité parasitaire de Plasmodium falciparum, × / μL – – – & lt; Taux de glucose dans le sang, mmol / L … – – Taux de lactate dans le sang, mmol / L … … – … Taux de bicarbonate dans le plasma, mmol / L – – – Taux d’hémoglobine, g / L – – – & lt; Niveau de créatinine plasmatique, μmol / L – – – & lt; Taux de bilirubine plasmatique, μmol / L – – – & lt; Caractéristique Contrôles sains n = Paludisme non compliqué n = Paludisme grave n = P Âge, mois – – – Sexe masculin, non% Poids corporel, kg – – – Température axillaire, ° C – – – & lt; Taux respiratoire, respirations / min – – – & lt; Blantyre Coma Score, no% & lt; – & lt; ≤ & lt; Convulsions multiples, non% & lt; La rate palpable, non% & lt; Densité parasitaire de Plasmodium falciparum, × / μL – – – & lt; Taux de glucose dans le sang, mmol / L … – – Taux de lactate dans le sang, mmol / L … … – … Taux de bicarbonate dans le plasma, mmol / L – – – Taux d’hémoglobine, g / L – – – & lt; Niveau de créatinine plasmatique, μmol / L – – – & lt; Taux de bilirubine plasmatique, μmol / L – – – & lt; NOTE Les données sont la gamme interquartile médiane, sauf indication contraire.

Plasma PfHRP- Concentrations

Les concentrations plasmatiques de PfHRP dans les groupes de sujets sont résumées sur la figure. Les concentrations médianes dans les groupes paludisme non compliqué et sévère et ng / mL, respectivement [IQR, -, et -, ng / mL, respectivement] n’étaient pas significativement différentes. étaient plus élevés que ceux des contrôles sains ng / mL [IQR, – ng / mL]; P & lt; Vingt-et-un des enfants en bonne santé%, dont% ayant un frottis sanguin positif pour le paludisme, avaient des concentrations plasmatiques décelables de PfHRP comprises entre et ng / mL. Le reste avait une concentration plasmatique indétectable de PfHRP et était parasparémique. groupes qui étaient parasitémiques lors de la présentation, mais qui ont eu un dosage PfHRP négatif, voir Figure

Figure Vue grandDownload Diapositive montrant la plage médiane, interquartile, maximale et minimale pour les concentrations plasmatiques de PfHRP dans les groupes d’enfants. Le seuil de positivité du test ng / mL est représenté par une ligne pointillée horizontale. Les chiffres entre parenthèses au-dessus de chaque boîte sont les total dans chaque groupe; ceux ci-dessous se réfèrent au nombre d’enfants dans chaque groupe avec des concentrations plasmatiques de PfHRP de & lt; ng / mL * P & lt; vs contrôles sainsFigure View largeTélécharger Diagramme montrant la médiane, l’intervalle interquartile, le maximum et le minimum pour les concentrations plasmatiques de PfHRP dans les groupes d’enfants Le seuil pour la positivité du test ng / mL est représenté par une ligne horizontale pointillée Les chiffres entre parenthèses sont le total dans chaque groupe; ceux ci-dessous se réfèrent au nombre d’enfants dans chaque groupe avec des concentrations plasmatiques de PfHRP de & lt; ng / mL * P & lt; vs contrôles sains Lorsque les enfants dans les groupes non compliqués et sévères ont été considérés ensemble, il y avait des corrélations bivariées significatives entre la concentration de PfHRP plasmatique logarithmique et la densité de parasites logarithmiques, le taux d’hémoglobine et le niveau de bilirubine plasmatique P & lt; dans chaque cas Figure Aucune corrélation significative n’a été observée pour d’autres variables associées à la gravité du paludisme chez les enfants, y compris Blantyre Coma Score Figure et, pour les cas graves seulement, niveau de lactate sanguin P & gt; dans chaque cas Les variables significatives ont été introduites dans un modèle de régression linéaire multiple incluant le taux de créatinine et d’alanine aminotransférase plasmatiques étant donné la possibilité que la PfHRP soit excrétée par voie rénale et / ou métabolisée par le foie même si aucune de ces variables n’était associée bivariée à la PfHRP plasmatique – concentration P & gt; Le modèle multivarié final est présenté dans le tableau La densité parasitaire journalière, le taux d’hémoglobine, le niveau de bilirubine plasmatique logarithmique et le taux de créatinine plasmatique étaient chacun indépendamment associés à la concentration plasmatique PfHRP P ≤ La valeur r ajustée était, avec les plus grandes variations de ce paramètre Δr = vu avec l’addition du niveau de bilirubine de plasma de journal au modèle

Tableau des associés indépendants du plasma Plasmodium falciparum protéine riche en histidine-concentration chez les enfants atteints de paludisme non compliqué ou sévère déterminée par l’analyse de régression linéaire multiple Associée β Coefficient SE P Connectez le niveau de bilirubine plasmatique & lt; Niveau d’hémoglobine, augmentation de g / L – & lt; Journal parasite densitya & lt; Niveau de créatinine plasmatique, augmentation de μmol / L Associate Coefficient β Se P Connectez le niveau de bilirubine plasmatique & lt; Niveau d’hémoglobine, augmentation de g / L – & lt; Journal parasite densitya & lt; Niveau de créatinine plasmatique, augmentation de μmol / L a Une augmentation de parasite par microlitre de densité de logarithme ou de mmol / L dans le niveau de bilirubine plasmatique logarithmique correspond à une augmentation de ces paramètres.

Figure Vue détailléeDétails de la concentration de PfHRP plasmatique contre la densité parasitaire, le taux d’hémoglobine et le taux de bilirubine plasmatique chez les enfants atteints de paludisme non compliqué ou grave Les cercles pleins représentent les enfants atteints de paludisme non compliqué et les cercles ouverts chez ceux atteints de paludisme grave. PfHRP- concentration contre la densité parasitaire, le taux d’hémoglobine et le taux de bilirubine plasmatique chez les enfants atteints de paludisme non compliqué ou sévère Les cercles pleins représentent les enfants atteints de paludisme non compliqué et les cercles ouverts ceux qui ont un paludisme grave.

Figure Vue détaillée Diapositive Diagramme montrant la médiane, l’intervalle interquartile, le maximum et le minimum des concentrations plasmatiques de PfHRP chez les enfants atteints de paludisme non compliqué et, par Blantyre Coma Score, chez les patients atteints d’infections sévères traitement de l’éjaculation précoce. Le seuil de positivité ng / mL est indiqué une ligne pointillée horizontale Les nombres entre parenthèses sont le total dans chaque groupe Il n’y avait pas de différences significatives entre les groupesFigure Vue largeDownload Diapositive Diagramme montrant la médiane, intervalle interquartile, maximum et minimum pour les concentrations plasmatiques de PfHRP chez les enfants atteints de paludisme non compliqué et, par Blantyre Coma Score, pour les infections sévères Le seuil de positivité du test ng / mL est représenté par une ligne pointillée horizontale Les chiffres entre parenthèses sont le total dans chaque groupe Il n’y avait pas de différences significatives entre les groupes présenté avec de multiples convulsions et la prostration est mort La densité de parasites à la présentation était, par micromètre olitre, et la concentration plasmatique de PfHRP était ng / mL, une valeur proche du groupe médian Un frottis cérébral post-mortem a révélé de nombreux parasites en phase terminale séquestrés dans la microvascularisation Tous les autres enfants ont répondu au traitement et ont bien été évacués

DISCUSSION

e également été attribué à un excès d’antigène, ainsi qu’à des anticorps bloquant le site cible de l’anticorps de détection. Ce phénomène de prozone peut être atténué par la dilution de l’échantillon Tous nos échantillons étant dosés en plusieurs dilutions avoir influencé nos données de concentration plasmatique, mais si cela aurait pu avoir un effet dans l’étude kenyane est inconnu La variation de la souche géographique dans PfHRP- pourrait également expliquer les écarts apparents entre la présente étude et les données publiées. Il a été montré que les régions répétées riches en histidine influent sur les performances des RDT PfHRP , reflétant le fait que l’anticorps monoclonal de capture est spécifique aux épitopes Une telle variabilité affectera également les dosages quantitatifs PfHRP. les concentrations se rapportent à l’âge et à la race Le modèle mathématique de la biomasse parasitaire développé par Dondorp et al était basé sur le dosage PfHRP Chez les adultes thaïlandais, aucun effet de l’insuffisance rénale n’a été observé sur la cinétique de PfHRP, et une demi-vie d’élimination moyenne du premier ordre a été obtenue. En revanche, nous avons trouvé une association indépendante positive significative entre la créatinine plasmatique et les taux de PfHRP, alors que dans l’étude kenyane d’Ochola et al , les concentrations plasmatiques moyennes de PfHRP n’ont pas changé au cours du premier jour suivant le traitement. Ces données suggèrent que la clairance de PfHRP est plus lente et plus dépendante de la fonction rénale chez les enfants que chez les adultes. la persistance de PfHRP – jusqu’à des semaines près de demi-vies sur la base de l’estimation fournie par Dondorp et al a été documentée chez des adultes utilisant des TDR , impliquant une variabilité significative entre les sujets dans la demi-vie d’élimination. savoir si cela a également été observé dans l’étude cinétique initiale réalisée par Dondorp et al. Une clairance lente de la PfHRP lors d’un épisode unique de paludisme pourrait augmenter les concentrations plasmatiques lors de la présentation mais pourrait aussi lorsque l’intervalle entre les récurrences du paludisme est court, comme le montre une transmission intense dans des zones telles que la PNG côtière et l’Afrique subsaharienne. L’association entre la créatinine plasmatique et les taux de PfHRP observés pourrait simplement suggérer que les deux sont des mesures de biomasse parasitaire La combinaison d’associations indépendantes entre la concentration plasmatique de PfHRP et le taux plasmatique de bilirubine, la densité parasitaire et le taux d’hémoglobine observé concorde avec l’hémolyse obligatoire des globules rouges parasités avec libération. De plus, le degré d’anémie chez nos enfants gravement malades et la présence d’une transmission intense des deux P falciparum et P vivax suggèrent que l’association avec l’hémoglobine peut également refléter, En partie, d’autres épisodes récents de paludisme et la persistance subséquente du PfHRP- Cela aiderait à expliquer la similitude entre les concentrations plasmatiques de PfHRP dans les groupes d’enfants atteints de paludisme et la présence de PfHRP détectable dans% de nos contrôles sains. Les biomarqueurs de la charge parasitaire tels que l’ADN parasitaire quantitatif ou la lactate déshydrogénase plasmodium peuvent être plus fiables que PfHRP- parce qu’ils ne persistent pas aussi longtemps après le traitement, mais ne sont pas mesurés dans la présente étude Bien que les données PfHRP plasmatiques initiales permettent d’estimer le parasite la biomasse peut être valide dans les zones de transmission faible et instable , les données actuelles suggèrent que cela est inapproprié dans les zones hyperendémiques et holoendémiques comme en Afrique et PNG En outre, la valeur clinique de PfHRP- comme un indice de gravité et un guide pronostique, qu’elle soit disponible en tant que concentration plasmatique simple ou en tant que partie d’une charge parasitaire mathématiquement dérivée, semble limitée Nous remercions également les membres du personnel médical et infirmier de la section de pédiatrie et du service de pédiatrie de l’hôpital Modilon, ainsi que les infirmières de recherche, les microscopistes, l’équipe de gestion des données et le personnel de soutien. de l’Institut de recherche médicale PNG pour l’assistance clinique et logistique, et du laboratoire et du personnel de recherche de l’hôpital de Fremantle Département de biochimie pour les tests biochimiques Cellabs a fourni les kits recombinants PfHRP et ELISA à un prix réduit Nous reconnaissons également le soutien de l’infrastructure de MalariaGen Soutien au financement du Réseau d’épidémiologie génomique Ce travail a été soutenu par le Conseil national australien de la recherche médicale et médicale, une bourse d’études à LM et une bourse de praticien à TMED; la bourse de la Fondation Fogarty à ML; la bourse d’études Basser du Royal Australasian College of Physicians aux conflits d’intérêts potentiels LMP Tous les auteurs: no conflicts