Pharmacophore raffine le design de la neurotoxine botulique nanométrique Serotype A Inhibiteurs de la chaîne légère

(BoNTs) sont les plus mortelles des toxines microbiennes connues; 1 par exemple, on estime qu’une dose de BoNT létale (DL50) pour Homo sapiens est de 1 ng kg   1 masse corporelle.1 En conséquence, ces enzymes sont classées comme: catégorie A, agents de bioterrorisme de la plus haute priorité par les Centres de contrôle et de prévention des maladies.2Sécrétés par des souches de bacilles anaérobies Clostridium botulinum, 1 il y a sept sérotypes BoNT connus (désignés A − G) ordonner ici. Serotype A − C, E et F provoquent le botulisme humain.3,4 Le mécanisme de l’intoxication neuronale BoNT peut être résumé comme suit: 1 (1) Activation postprotéolytique, l’enzyme se compose d’une chaîne lourde de 100 kDa liée au disulfure ( HC) et une chaîne légère de 50 kDa (LC); (2) le HC se lie aux récepteurs de la surface cellulaire neuronale, déclenchant l’internalisation de la toxine via une vésicule intracellulaire; (3) le HC médie la translocation LC hors de la vésicule intracellulaire dans le cytosol neuronal; et (4) la LC [une métalloprotéase de zinc (Zn) (II) scinde, en fonction du sérotype, l’une des trois protéines (voir ci-dessous) composant le complexe récepteur de protéine de fixation de protéine de fusion N-éthylmaléimide soluble (SNARE). Le complexe SNARE négocie la libération de vésicules synaptiques contenant de l’acétylcholine dans les jonctions neuromusculaires. L’inhibition induite par la toxine de la libération d’acétylcholine, via la protéolyse des protéines SNARE, met fin à la signalisation de neurone à muscle, entraînant la paralysie flasque potentiellement mortelle associée au botulisme. Les sérotypes BoNT A, E et C clivent la protéine associée aux synaptosomes de 25 kDa (SNAP-25) 1, le sérotype Bo LCT clive également la syntaxine, 1 et les LC des sérotypes B, D, F et G de BoNT clivent la vésicule. Actuellement, il n’y a pas de traitement disponible pour le traitement de la paralysie post-neuronale à médiation par BoNT LC-mediated.Ceci est crucial, car les traitements actuels pour l’intoxication BoNT sont limités à (1) l’administration d’antitoxine (s), 1,5 qui n’est pas efficace intoxication post-neuronale6 et, par conséquent, serait d’utilisation limitée suite à un acte de bioterrorisme (comme (2) la ventilation mécanique, qui est nécessaire une fois que la paralysie induite par BoNT compromet la contraction du muscle thoracique.5 Cependant, cette dernière forme de traitement serait également irréalisable même après un certain temps. Il existe donc un intérêt considérable à découvrir et à développer de petites molécules comme agents thérapeutiques pour inhiber l’activité protéolytique de la BoNT LC, une intoxication post-neuronale.1,8,9 En outre, il existe un intérêt considérable pour la bioterrorisme. en ce qui concerne le développement de petites molécules thérapeutiques, le sérotype BoNT A LC (BoNT / A LC) représente une priorité absolue, tout comme d’autres LC BoT connus pour provoquer le botulisme chez l’homme, possède donc la plus longue durée d’activité dans le cytosol neuronal.3,4 Ainsi, l’hypothèse rationalisant une approche thérapeutique à base de petites molécules pour le traitement de l’intoxication par BoNT / A LC est la suivante: De petites molécules druglike peuvent pénétrer dans le cytosol neuronal10 et inhiber l’activité protéolytique LC de la toxine de la toxine intoxication post-neuronale. À son tour, ce mécanisme protégerait SNAP-25 et, par conséquent, la fonction du complexe protéique SNARE. De plus, si elles sont stockées dans des endroits secs, à l’abri du soleil et à température contrôlée, les petites molécules chimiquement stables resteront viables pendant de nombreuses années. En revanche, les vaccins ont des durées de conservation relativement plus courtes. Les structures de rayons X actuelles du BoNT / A LC échouent à rationaliser la structure des relations d’activité (SAR) pour notre petite molécule chélatante compétitive, non-Zn (II) ( inhibiteurs non peptidiques (SMNPI) de la BoNT / A LC.10 − 12 Pour cette raison, nous utilisons avec succès une approche basée sur le pharmacophore en phase gazeuse pour la découverte et l’optimisation SMNPI.11,12 Ce paradigme utilise un itératif efficace approche: les SMNPI sont continuellement intégrés au pharmacophore pour développer des requêtes de recherche tridimensionnelles (3D) afin de découvrir de nouveaux chimiotypes SMNPI (via l’exploration de bases de données 3D de bibliothèques de petites molécules) et guider la conception rationnelle de dérivés SMNPI plus puissants. Les données sur l’activité de la structure, provenant à la fois des SMNPI à base de données et rationnellement conçues, sont intégrées au modèle, ce qui permet d’améliorer le pharmacophore.10 − 13En utilisant cette stratégie, nous avons récemment signalé une itération du pharmacophore à trois zones. BoNT / A LC inhibition11 qui a guidé la conception des régioisomères SMNPI 1a et 1b à base de 2- [4- (4-amidinephénoxy) phényl] indole-6-amidine (2,4,4-APPIA) (Tableau 1). Les tests in vitro de 1a et 1b ont indiqué que les régioisomères possèdent un Ki = 0,600 μ M (± 0,100 μ M). Cependant, il est important de noter que les groupements bis-amidine substitués de 1a et 1b ne sont pas chimiquement stables pendant la séparation par chromatographie liquide à haute performance (HPLC), ce qui interdit l’isolement du régioisomère. De plus, les synthèses sélectives des régioisomères individuels la et lb sont également prohibitives; par conséquent, nous explorons actuellement d’autres fractions cationiques pour faire progresser le développement et l’optimisation de ce chémotype. En outre, nous avons rapporté comment le pharmacophore à trois zones a été utilisé pour générer une requête de recherche 3D qui a identifié le nouveau SMNPI 2 à base de bis- [3-amide-5- (imidazolino) phényl] téréphtalamide (BAIPT), (Tableau 1), 12 un inhibiteur de plomb possédant un Ki = 8,52 μ M (± 0,53 μ M). La découverte de 2 était particulièrement convaincante parce que l’un de ses substituants bis-butylamide est situé à l’extérieur de l’itération à trois zones du pharmacophore, 12 impliquant la possibilité d’une quatrième zone d’occupation SMNPI (Figure 1a) .1a ). Fait important, une nouvelle zone pharmacophore 4 pourrait potentiellement être exploitée pour découvrir de nouveaux chémotypes SMNPI, ainsi que pour guider l’optimisation synthétique de nos SMNPI connues. Alignements 1SMNPI dans une itération à trois zones précédemment rapportée du pharmacophore pour l’inhibition de BoNT / A LC. 11,12 Les atomes de chlore sont vert clair, les atomes d’azote sont bleus et les atomes d’oxygène sont rouges. Les carrés indiquent les composants planaires du pharmacophore, et … Tableau 1SMNPI Structures bidimensionnelles et Constantes d’InhibitionPour examiner initialement la possibilité d’un pharmacophore à quatre zones, des conformations intramoléculaires stériquement réalisables de 1a, 1b et 2 ont été superposées en phase gazeuse. Comme le montre la figure ​ Figure2a, 2a, les SMNPI superposés avec une bonne complémentarité chimique.Les composants 4-amino-7-chloroquinoline (4,7-ACQ) de 1a et 1b et les méthylènes terminaux des substituants butylamide de 2 peuvent occuper des positions proximales dans la zone empiriquement vérifiée 311 et la zone pharmacophore hypothétique est particulièrement importante pour le raffinement du pharmacophore. 4, respectivement (Figure ​ (Figure2a) 2a) (avec les composants 4,7-ACQ fournissant une plus grande occupation zonale). De plus, en ce qui concerne le raffinement du modèle, les nouvelles superimpositions SMNPI sont en contraste avec notre pharmacophore à trois zones précédemment publié, 11 qui prédit que les composantes 4,7-ACQ de 1a et 1b occupent seulement la zone 3 de ce modèle (Figure ​ (Figure11b). Figure 2Alignements tridimensionnels des SMNPI 1a, 1b et 2 dans le contexte du pharmacophore raffiné à quatre zones pour l’inhibition de BoNT / A LC, et des conceptions rationnelles basées sur le nouveau modèle. et les définitions de forme sont comme indiqué sur la figure ​ … En outre soutenir un modèle de pharmacophore à quatre zones sont les superpositions des SMNPI dans les exigences des zones 1 et 2 (Figure & a); 12 En particulier, dans la zone 1 (Figure ​ (Figure 2a), 2a), (1) les amidines cationiques de 1a et 1b et l’imidazoline cationique de 2 sont situées à proximité et possèdent des orientations directionnelles comparables, (2) des azotes indoles donneurs de liaisons hydrogène de la et 1b se superposent avec un hydrogène l’amide donneur d’azote azoté du noyau “ le noyau ” téréphtalamide de 2, (3) les composants phényles des indoles de 1a et 1b s’alignent étroitement avec le phényle occupant la zone 1 de 2, et (4) les phényles centraux de 1a et 1b se superposent au téréphtalamide phényle de 2. Il est notable que dans le pharmacophore raffiné à quatre zones (figure ​ (figure2a) 2a) par rapport à l’itération à trois zones du modèle (figure ​ (figure1), 1), les cycles phényliques centraux de 1a, 1b , et 2 forment la base clé pour l’alignement SMNPI et, par conséquent, sont maintenant inclus dans la composante planaire de la zone 1 (référence Figure ​ Figure11 vs Figure ​ Figure2a) .2a). Dans la zone 2 (figure ​ (figure 2a), 2a), (1) les oxygènes d’éther de 1a et 1b se superposent avec, et sont orientés dans le même sens qu’un téréphtalamide carbonyle oxygène de 2, (2) les phényles de 1a et 1b sont situés à proximité et partiellement en chevauchement avec le phényle occupant la zone 2 de 2 et (3) les amidines cationiques de 1a et 1b et l’imidazole cationique de 2 s’alignent en bon ordre et avec des orientations directionnelles équivalentes La complémentarité chimique 3D observée pour 1a, 1b et 2, lorsqu’elle est alignée dans le pharmacophore à quatre zones (Figure 2a), 2a), a formé la base de la conception de dérivés pour améliorer la puissance inhibitrice du Chémotype SMNPI basé sur BAIPT. Spécifiquement, le pharmacophore à quatre zones a indiqué que l’attache des substructures 4,7-ACQ sur les amides terminales du chimiotype BAIPT “ avec des groupes de liaison alkyle (voir les dérivés 3 − 5, Figure ​ Figure2b) 2b) se traduirait par des SMNPI avec des puissances inhibitrices améliorées. De plus, comme le montre la figure ​ Figure2b, 2b, 3 − 5 ont été conçus pour fournir SAR explorant les longueurs des chaînes alkyles [ie, éthyls (3), propyls (4), et butyles (5)] attachement des zones 4, 7-ACQ, 3 et 4 occupant les composants aux amides amides terminales du chimiotype BAIPT “. Le schéma 1 montre la procédure de synthèse générale utilisée pour préparer 3 − 5. La génération des composés cibles a commencé avec des tentatives répétées de réduction de l’acide 3-cyano-5-nitrobenzoïque (6) en l’aniline 7 correspondante par hydrogénation catalytique; cependant, des quantités substantielles de produits de réduction incomplète ont été constamment observées. Pour contourner cet obstacle, le transfert d’hydrogène, plutôt que l’hydrogénation catalytique, a été utilisé pour générer avec succès un rendement de 7 à 77% après acidification avec de l’acide formique et cristallisation dans l’eau. Après, 7 et 8 ont été couplés en utilisant une procédure modifiée rapportée par Sellarajah et al.14 pour fournir l’intermédiaire clé 9 en un rendement de 92% après trempe avec de l’eau et cristallisation à partir d’acétonitrile. Ensuite, la formation de liaison amide entre 9 et les aminoquinoléines 15 correspondantes a été réalisée à température ambiante en utilisant HOBt et EDCl dans un solvant DMA pour fournir des intermédiaires dinitrile 10 « , respectivement. La transformation de 10 « en cibles d’imidazoline correspondantes 3 » a été réalisée par réaction avec de l’éthylènediamine et du NaSH dans un solvant DMA à 120 ° C, en utilisant un mode opératoire modifié de Sun et al.16 Enfin, les sels de 3 Ȣ 5 ont été obtenus en agitant avec de l’acide méthanesulfonique dans de l’acétonitrile à 70 ° C; Les procédures de synthèse détaillées et les caractérisations des composés sont fournies à titre d’information de soutien.Schéma 1Synthèse des SMNPI à base de BAIPT 3 − 5Les valeurs de Ki pour 3 − 5 (Tableau 1) ont été déterminées à l’aide d’un test HPLC bien documenté.17 − 22 Les conceptions à base de pharmacophore à quatre zones étaient toutes plus puissantes que 2 [Ki = 8,52 μ M (± 0,53 μ M)]. Plus précisément, 3 − 5 possèdent des valeurs Ki de 2.12 (± 0.26 μ M), 0.572 (± 0.041 μ M), et 0.900 μ M (&#x000b1 0,078 μ M), respectivement (Tableau 1). De plus, les courbes des données de cinétique d’inhibition pour 3 & spplus indiquent que tous sont des inhibiteurs compétitifs (Information de support, Figures S1 − S3), et des analyses in vitro supplémentaires des SMNPI en présence de concentrations de Zn (II) égales 5, 10, 25 et 50 μ M n’a pas eu d’effet inhibiteur (Information de support, Tableau S1), indiquant ainsi que les SMNPI ne chelatent pas le Zn (II) du moteur catalytique de l’enzyme. Les résultats in vitro obtenus pour 3 − 5 (Tableau 1) confirment la présence de la zone 4 du pharmacophore. De plus, les puissances inhibitrices accrues de 3 − 5, contre 2, démontrent qu’à chaque raffinement de la phase gazeuse pharmacophore, la résolution prédictive du modèle est améliorée et il peut être utilisé pour concevoir des SMNPI plus puissants. Sur la base du SAR fourni par 3 − 5, la puissance inhibitrice de 4 implique que la longueur optimale de l’attache alkylique reliant SMNPI les composants sont une chaîne propyle. En revanche, la puissance inhibitrice de 3 indique que des éthylènes plus courts ne permettent pas aux fractions 4,7-ACQ du SMNPI d’atteindre les zones optimales 3 et 4, alors que la puissance inhibitrice de 5 indique que les filons butyl allongés excèdent les 4,7- Liaison ACQ dans les zones 3 et 4. Pour fournir un SAR qui guidera l’optimisation SMNPI (in vitro), les futures conceptions basées sur BAIPT exploreront non seulement les effets des attaches modifiées (par exemple, les linkers avec une rigidité accrue et l’inclusion des hétéroatomes) sur L’inhibition de BoNT / A LC, mais comprendra également une diversité de composants occupant la zone 3 et la zone 4 (par exemple, les indoles, les phényles, les pyridines, etc.). En outre, des études futures seront également menées pour examiner la protection et la toxicité SMN-25 de SMAPI basée sur BAIPT dans les neurones. En résumé, notre pharmacophore en phase gazeuse pour l’inhibition de BoNT / A LC permet constamment la conception rationnelle de SMNPI plus puissants. Dans la présente étude, une itération raffinée à quatre zones du modèle a été générée par la superposition 3D de deux chimiotypes SMNPI différents. Pour valider empiriquement le modèle affiné, trois composés cibles basés sur le chémotype BAIPT “ core ” ont été synthétisés et examinés in vitro. Parmi les trois modèles, tous sont plus puissants que le composé mère 2, tandis que 4 est le SMNPI le plus puissant, non chélatant, non-Zn (II), contenant de l’acide non-hydroxamique, rapporté par le BoNT / A LC. De plus, la comparaison des puissances inhibitrices de 1a, 1b et 4 indique qu’un lien propyle peut être optimal pour accéder aux zones 3 et 4 du pharmacophore avec une fraction aromatique. En général, le modèle pharmacophore raffiné constitue la base pour augmenter les activités de nos chémotypes SMNPI non chélatant le Zn (II). Les futures conceptions à base de pharmacophore à quatre zones se concentreront sur le développement de SAR pour fournir des stratégies d’optimisation des compositions chimiques et stériques des composants SMNPI qui peuplent les zones 3 et 4 (par exemple, les composantes 4,7-ACQ de 1a, 1b et 3 &#x02212 5), ainsi que la flexibilité / rigidité et la composition des attaches entre les zones 1 et 4 et les zones 2 et 3 (par exemple, les linkers propylés de 4).