Manifestations cliniques et caractérisation moléculaire de Bordetella pertussis pertactin-déficient et pertactin chez les enfants, Philadelphie –

Des souches de Bordetella pertussis manquant d’expression de la pertactine, une cible d’adhésine bactérienne et de vaccin, émergent Il existe des données limitées sur les manifestations pathologiques des souches mutantes chez les enfants Nous avons cherché à comparer les manifestations cliniques de l’infection B pertussis et de la pertactine chez les nourrissons. Caractéristiques moléculairesMéthodesLa caractérisation moléculaire d’isolats de B pertussis archivés de janvier à mars comprenait l’analyse par transfert de Western, l’électrophorèse en champ pulsé, la réaction en chaîne par polymérase et le séquençage du gène de la pertactine. Infections à pertussisRésultatsSixties d’isolats de B pertussis étaient viables pour l’analyse Au sein de la cohorte de nourrissons, l’âge médian était de jours, le% reçu ≤ dose de vaccin et% hospitalisé. La carence en pertactine a été notée pour la première fois. Prévalence Il n’y avait pas de différences statistiquement significatives dans la présentation des symptômes ou signes, hospitalisation, soins intensifs, assistance respiratoire ou résultats de laboratoire liés à l’expression de la pertactine. La durée de la maladie était plus courte dans les groupes déficients en pertactine; P =; aucune différence n’a été notée dans le sous-groupe des nourrissons & lt; Analyses moléculaires identifiées Profils PFGE Centres de contrôle et de prévention des maladies Profil Pas prédominant,% Dans des souches déficientes en pertactine, le séquençage a identifié le codon stop et les localisations IS perturbant le gène prn Les mutations et les positions nucléotidiques n’étaient pas uniques au type PFGE. Dans cette cohorte de nourrissons majoritairement non immunisés, la maladie clinique ne différait pas entre l’infection par déficit en pertactine et ceux avec pertussine B pertussis. Les analyses moléculaires ont démontré une diversité de souches PFGE remarquable, avec de multiples mécanismes et sites moléculaires d’inactivation de la pertactine

Bordetella, pertactin, coqueluche, vaccin anticoquelucheux acellulaireMême si des doses de vaccin anticoquelucheux sont recommandées entre l’âge de quelques mois et l’adolescence aux États-Unis et des taux élevés de couverture, la coqueluche est actuellement la maladie la moins bien contrôlée contre la vaccination . en Californie dans et, et dans l’état de Washington et plusieurs autres états dans et entre, tous les états des États-Unis sauf la Californie ont signalé une augmentation de la coqueluche, et le nombre de cas à l’échelle nationale était plus élevé que l’incidence la plus élevée de la maladie a été observée chez les nourrissons & lt; Une recommandation pour l’administration universelle de la dose de renforcement de l’anatoxine tétanique, de l’anatoxine diphtérique à contenu réduit et du vaccin antigrippal anticoquelucheux acellulaire Tdap chez les enfants âgés de moins de Les cas d’adolescents L’évolution épidémiologique de la coqueluche a cependant changé brusquement, comme on l’a noté dans l’épidémie de Californie, l’épidémie de Washington et les rapports nationaux. Après les nourrissons, les taux les plus élevés sont observés chez les enfants de chez les personnes complètement vaccinées Des preuves considérables suggèrent que le déclin précoce et progressif de la protection contre les vaccins anticoquelucheux acellulaires – diphtérie pédiatrique, anatoxine tétanique et vaccin antigénique anticoquelucheux acellulaire DTaP et Tdap – est la principale cause de l’augmentation des cas , et que la réversion rapide de la sensibilité dans quelques années de vaccination s’est produite dans la cohorte de vaccinés dont la série c Un autre facteur contribuant à l’augmentation du nombre de cas est un changement de Bordetella pertussis lui-même, qui semble s’être adapté sous la pression sélective des vaccins La protéine pertactine jouerait un rôle dans la pathogenèse microbienne de la B pertussis. comme une adhésine dans l’interface bactérie-cellule hôte et fonctionnellement dans la résistance à la clairance par les neutrophiles La plupart des vaccins anticoquelucheux acellulaires, et tous les vaccins américains, contiennent la pertactine de type allèle prn Par le s, allèle type de pertactine vaccin-divergent prn était le Depuis les années s, au cours de l’ère du vaccin anticoquelucheux acellulaire exclusif dans de nombreux pays, les souches B pertussis déficientes en pertactine représentent une faible proportion des isolats cliniques au Japon, en France. , La Finlande, l’Australie et le Canada , et a augmenté rapidement en Australie de Pertussin B pertussis a été décrite pour la première fois aux Etats-Unis par Queenan et al , parmi des isolats de nourrissons pris en charge dans notre institution en -La coqueluche nouvellement résurgente chez les enfants plus âgés, les adolescents et les adultes a été considérée comme légère , mais dans, presque exclusivement chez les nourrissons & lt; mois Les données cliniques rapportées sur les cas de B pertussis déficient en pertactine sont limitées , incluant généralement les cas survenant pendant les flambées et chez les personnes précédemment immunisées chez qui la coqueluche est moins symptomatique En outre, les données cliniques La perte d’un facteur de virulence significatif chez des souches déficientes en pertactine pourrait conduire à des manifestations améliorées de la maladie ou la perte d’une cible majeure d’anticorps vaccinaux pourrait faciliter un développement prolongé. Maladie Les objectifs de notre étude étaient d’étudier la prévalence de souches B pertussis déficientes en pertactine parmi les isolats cliniques de nourrissons principalement non vaccinés, jeunes et non vaccinés, sur une période d’une année dans une seule région géographique; délimiter les types d’antigènes, la clonalité, l’expression de la pertactine et les mutations génétiques prn des isolats; et déterminer si les manifestations cliniques des cas dus à des souches déficientes en pertactine et à la pertactine B pertussis diffèrent

Méthodes

Tous les cas de coqueluche confirmée ont été identifiés rétrospectivement de janvier à mars dans un hôpital pour enfants en soins tertiaires du nord de Philadelphie desservant une population urbaine défavorisée sur le plan socioéconomique. Les cas ont été confirmés par culture, réaction en chaîne par polymérase ou par immunofluorescence directe. pratiquer dans notre établissement pour pratiquer la culture en utilisant de la gélose Regan-Lowe sur des échantillons respiratoires prélevés chez des patients suspects de coqueluche qui sont hospitalisés ou évalués à l’urgence; Bien que le test de dépistage de la B pertussis ait été introduit en septembre, la culture standard a également été poursuivie. Seuls les cas positifs pour la culture avec des isolats archivés viables ont été inclus pour la caractérisation clinique et l’analyse moléculaire. Pour la caractérisation moléculaire, les isolats ont d’abord été analysés pour déterminer la présence de pertactine par Western Blot. La culture de A-mL a été cultivée pendant une nuit dans un milieu Stainer-Scholte à une température de 100 ° C. Les cellules ont été récoltées par centrifugation -rpm et remises en suspension dans une solution saline avant la lyse avec un homogénéisateur FastPrep. Environ μg de lysat de protéine a été appliqué sur des gels NuPAGE dans du tampon MOPS Life Sciences Les protéines ont été transférées sur des membranes de polyvinylidène difluorure avec un appareil iBlot. a été détecté avec l’Institut national de biologie L’antisérum anti-K standard et de contrôle: dilution, utilisant le Western Breeze Kit anti-chèvre Life Sciences Le contrôle positif à la pertactine a été réalisé par l’AF, l’AR, le BF, le BR, le PRF et le PRR amorces de Mooi et al Le bleu platine SuperMix Invitrogen a été utilisé avec du diméthylsulfoxyde% Les amorces ont été utilisées à une concentration de μmol / L Les produits ont été amplifiés en ° C pendant quelques minutes, puis en cycles de ° C pendant quelques secondes, et ° C pour les minutes et les cycles de ° C pour secondes, ° C pour secondes et ° C pour minutes. Les produits de PCR ont été séquencés par ACGTPFGE en digérant l’ADN dans des bouchons d’agarose avec des fragments d’ADN XbaI d’enzyme de restriction ont été séparés en% gels d’agarose. × Tampon d’acide tris-borate-éthylènediamine-tétraacétique à V / cm pendant 1 heure à ° C, avec un temps de commutation de – secondes, puis heures, avec un temps de commutation de – secondes Les gels ont été colorés avec SYBR Green et les bandes d’ADN ont été visualisées en utilisant Une lettre a été assignée aux types PFGE de lumière UV et, dans la mesure du possible, à un numéro de profil CDC des Centers for Disease Control et Prevention basé sur les caractéristiques des isolats déficients en pertactine rapportés ailleurs Les dossiers médicaux de tous les cas confirmés par culture ont été examinés rétrospectivement collecter des données pour: démographie; caractéristiques cliniques de la présentation et de la sévérité de la maladie; histoire du vaccin; les taux et la durée de l’hospitalisation, l’admission dans une unité de soins intensifs et le soutien respiratoire; les taux de mortalité; et résultats des tests de laboratoire Les données relatives aux cas provoqués par des souches déficientes en pertactine et celles produisant de la pertactine ont été comparées à l’aide des analyses de test χ, Fisher exact et Student t, selon le cas.

RÉSULTATS

Résultats cliniques

Quatre-vingt-deux cas de coqueluche en laboratoire ont été identifiés au cours de la période d’étude. Dix cas ont été exclus de la PCR positifs, des anticorps fluorescents positifs uniquement parce que la culture n’a pas été réalisée ou des résultats négatifs. La non-viabilité des organismes congelés représentait% des cas confirmés pendant la période d’étude. Les cas exclus provenaient de toutes les années d’étude. Les cas exclus dus à des organismes non viables présentaient des caractéristiques démographiques et cliniques similaires à celles de la cohorte d’étude, à l’exception les seuls patients atteints d’hypertension pulmonaire et de décès étudiaient des années et présentaient des isolats non viables. Tous les dossiers médicaux des patients étaient disponibles pour examen. En général,% n = de la population étudiée avait une infection par des souches B pertussis déficientes en pertactine. et ces souches ont généralement augmenté au cours des années d’étude Figure La majorité des cas dus à des souches déficientes en pertactine sont survenus et n =, représentant% de tous les cas de souches déficientes en pertactine Aucun cas de coqueluche confirmé en laboratoire n’a été identifié sur la Figure Agrandir l’imageTélécharger l’expression de la bactérie Bordetella pertussis par année, à St Hôpital de Christopher pour les enfants, janvier à mars L’expression de la pertactine a été déterminée par analyse de transfert de Western pour chaque isolat de B pertussis Aucun cas de coqueluche confirmée en laboratoire n’a été observé par an, à l’hôpital St Christopher’s Children, janvier L’expression de la pertactine a été déterminée par analyse de transfert de Western pour chaque isolat de B pertussis. Aucun cas de coqueluche confirmée en laboratoire n’a été observé. Les caractéristiques démographiques et cliniques de la population étudiée sont comparées aux cas de B pertussis et déficients en pertactine. Tableau L’âge médian de la cohorte w comme jours; % des patients étaient & lt; Moins de% de la cohorte avaient un trouble sous-jacent identifiable et aucun patient n’avait de cardiopathie congénitale, de maladie neuromusculaire, d’immunodéficience ou de malignité La durée moyenne de la maladie avant la présentation était plus courte pour la différence moyenne du groupe déficient en pertactine, jours; Cependant, les nourrissons infectés par des souches déficientes en pertactine présentaient moins de vomissements post-lombaires, d’apnée et d’étouffement ou de bâillonnement, mais la cyanose était plus souvent rapportée dans les cas dus à la pertactinémie. produisant B coqueluche, il y avait une tendance à signaler un contact relatif au premier degré avec la maladie P = le statut vaccinal documenté était approprié en% de la cohorte retardé en% et inconnu en%; toutefois, en raison de leur jeune âge,% des patients ayant des antécédents vaccinaux connus n’avaient reçu aucune dose ou juste une dose de DTaP Aucune mère n’avait reçu de dcaT pendant la grossesse Tableau Caractéristiques démographiques et cliniques des patients atteints de coqueluche confirmée par la culture, par expression de pertactine, janvier -Mars Caractéristiques Patients, Non% a Cohorte de l’étude n = Cas de coqueluche dus à la pertactinémie

Isolats déficients n = Cas de coqueluche dus à la pertactinémie

Production d’isolats n = P Valeurb Âge, intervalle médian d d-y d d-y d d-y … Groupe d’âge ≤ y & lt; Mo Sexe Mâle Femelle Race Noir Blanc & gt; Autre couverture Medicaid Conditions sous-jacentes Prématurité Asthme Drépanocytose & gt; Durée de la maladie avant la présentation, d Moyenne Gamme médiane – – – … Présence de signes ou de symptômes Toux Symptômes URTI Postémulsion post-traumatique Étouffement ou bâillonnement Cyanose Apnée / ALTE Contacts avec les malades identifiés Tout contact st-degré relatif Gravité de la maladie Hospitalisationc Durée moyenne du séjour, médiane durée du séjour, d intervalle – – – … Admission à l’unité de soins intensifs Soutien respiratoire Canule nasale oxygène … Pression positive non invasive … Intubation … Caractéristiques Patients, Non% a Cohorte de l’étude n = Cas de la coqueluche dus à la pertactinémie

Isolats déficients n = Cas de coqueluche dus à la pertactinémie

Production d’isolats n = P Valeurb Âge, intervalle médian d d-y d d-y d d-y … Groupe d’âge ≤ y & lt; Mo Sexe Mâle Femelle Race Noir Blanc & gt; Autre couverture Medicaid Conditions sous-jacentes Prématurité Asthme Drépanocytose & gt; Durée de la maladie avant la présentation, d Moyenne Gamme médiane – – – … Présence de signes ou de symptômes Toux Symptômes URTI Postémulsion post-traumatique Étouffement ou bâillonnement Cyanose Apnée / ALTE Contacts avec les malades identifiés Tout contact st-degré relatif Gravité de la maladie Hospitalisationc Durée moyenne du séjour, médiane durée du séjour, d intervalle – – – … Admission à l’unité de soins intensifs Soutien respiratoire Canule nasale oxygène … Pression positive non invasive … Intubation … Abréviations: ALTE, événement apparent potentiellement mortel; Unité de soins intensifs, unité de soins intensifs; URTI, infection des voies respiratoires supérieuresa Les données représentent% de patients sauf indication contraire. Les valeurs de pP pour la comparaison entre les patients atteints de coqueluche due à des isolats déficients en pertactine et ceux produisant de la pertactinec. Les pourcentages pour cette colonne sont basés sur le dénominateur patients hospitalisés seulement n = Quarante-trois patients% de la cohorte ont été hospitalisés et la majorité de ces patients n = avaient une infection avec des souches déficientes en pertactine. Les taux d’hospitalisation variaient de% à% annuellement et ne différaient pas entre les cas La durée médiane d’hospitalisation et la sévérité de l’évolution clinique étaient similaires entre les groupes Globalement,% de la cohorte de l’étude était admise à l’unité de soins intensifs, et% de ces patients avaient besoin d’un soutien respiratoire; il n’y avait pas de différences apparentes entre les patients atteints de déficit en pertactine et de pertactine B. La moitié des patients de l’étude présentaient une numération leucocytaire complète, le nombre médian de globules blancs dans les globules blancs montrant une numération leucocytaire médiane leucocytaire / μL; Pourcentage de lymphocytes Les résultats initiaux des tests de laboratoire pour les cas dus à des souches productrices de pertactine et déficientes en pertactine étaient des numérations WBC médianes similaires, / μL vs / μL, respectivement; proportion de lymphocytes,% vs%; numération lymphocytaire absolue, / μL vs / μL; et numération plaquettaire, / μL vs / μL; tout P & gt;

Résultats de l’analyse des sous-groupes cliniques

Nourrissons & lt; mois d’âge n = ont été considérés séparément parce qu’ils représentent un sous-groupe à risque accru de maladie grave Trente-six des cas hospitalisés% sont survenus chez les nourrissons & lt; La proportion de cas de carence en pertactine et de cas de pertactine était semblable à celle de tous les patients hospitalisés. Parmi ces jeunes enfants, il n’y avait pas de différences cliniques apparentes entre les cas dus à la coqueluche B déficient en pertactine et la pertactine. avant la présentation, présenter les signes et les symptômes, l’identification des contacts sources probables, la gravité de la maladie ou le niveau de données sur les soins hospitaliers non indiqués; tout P & gt;

Résultats moléculaires

Le séquençage de la totalité de la région codant pour la pertactine a révélé que tous les isolats, sauf l’isolat, portaient l’allèle prn. Un seul isolat provenant de l’allèle prn. Un total de% d’isolats n’avait pas de protéine pertactine identifiable par Western blot; Les isolats avec expression de la pertactine n’avaient pas de mutation prn détectée. La Figure met en évidence les caractéristiques moléculaires de la cohorte par année et le type PFGE Onze profils PFGE ont été identifiés parmi les isolats, corrélés avec les types PFGE publiés CDC,,, et CDC et les CDC étaient présents tout au long de la période d’étude, le type de CDC prédominant pour la cohorte de l’étude. Le CDC semble être passé à un état déficient en pertactine, sans isolat de CDC produisant la pertactine puisque les isolats de CDC sont restés pertactin. produisant jusqu’à ce que les types de CDC et de CDC soient apparus en tant que variants à prédominance pertactine-déficients de; % Figure View largeToile de téléchargementCaractéristiques moléculaires des isolats de Bordetella pertussis par année et électrophorèse en champ pulsé Type PFGE, Hôpital St Christopher pour enfants, janvier-mars Chaque petite boîte représente un seul isolat de B pertussis Les lettres A-L représentent des motifs PFGE distincts et corrélent avec modèles publiés CDC PFGE des Centers for Disease Control et Prévention, selon le cas Les mécanismes de rupture des gènes sont notés pour les isolats, avec la position des nucléotides entre parenthèses Case grise = isolat producteur de pertactine; Boîte noire = isolat déficient en pertactine Abréviations: IS, séquence d’insertion; Stop, stop codonFigure Vue largeTélécharger les caractéristiques moléculaires des isolats de Bordetella pertussis par année et par électrophorèse en champ pulsé Type PFGE, Hôpital St Christopher pour enfants, janvier-mars Chaque petite boîte représente un seul isolat B pertussis Les lettres A-L représentent des motifs PFGE distincts. corréler avec les modèles publiés de CDC PFGE des Centers for Disease Control et Prevention, selon le cas. Des mécanismes de perturbation génétique sont notés pour les isolats, avec la position des nucléotides entre parenthèses Case grise = isolat producteur de pertactine; Boîte noire = isolat déficient en pertactine Abréviations: IS, séquence d’insertion; Arrêter, arrêter le codonLes isolats producteurs de pertactine appartenaient aux types PFGE et les isolats déficients en pertactine appartenaient aux types PFGE Quatre types PFGE présentaient à la fois des isolats déficients en pertactine et des isolats déficients en pertactine Parmi les isolats déficients en pertactine, le séquençage du gène entier En outre, les codons stop ont été identifiés à des endroits arrêtés et, alors que IS a été noté à des emplacements nucléotidiques, et à l’intérieur du gène prn, les mécanismes de mutation et les positions nucléotidiques n’étaient pas uniques au type PFGE, Les codons d’arrêt à la position étaient la mutation la plus commune, trouvée dans les isolats parmi les types de PFGE, suivie par IS dans les isolats parmi les types de PFGE.

DISCUSSION

infection causée par la coqueluche acellulaire B coqueluche est une infection muqueuse hautement contagieuse pour laquelle ni la maladie ni la vaccination n’offrent une immunité prolongée contre la maladie ou la protection contre la colonisation. Ces circonstances favorisent l’adaptation sous pression sélective avec évolution continue des «mutants d’échappement». La divergence antigénique des souches circulantes des souches vaccinales a été observée aux États-Unis et dans le monde entier Les changements dans les allèles prédominants ptx, prn et fim ont été les premières divergences par rapport aux antigènes vaccinaux, suivis du changement de la toxine. gène promoteur, ptxP Seul le changement dans le gène promoteur, qui régulé positivement l’expression de la toxine pertussis, a été systématiquement associé à des notifications accrues de coqueluche en Europe L’apparition récente et prolongée de pertussis B pertussique multiclonal est un phénomène associé à l’utilisation des vaccins anticoquelucheux acellulaires aux États-Unis et d’autres pays et ne s’est pas produit dans des pays comme la Pologne et la Serbie où des vaccins à germes entiers continuent d’être utilisés La première souche de B pertussis déficient en pertactine dans notre cohorte a été isolée, avec une prévalence croissante dans les années suivantes. prévalence de% pour la période d’étude Le criblage d’isolats cliniques américains provenant de collections épidémiques et de surveillance nationales a révélé que la première souche déficientée en pertactine était isolée, et la seconde seulement pendant une éclosion californienne. Depuis, les souches déficientes en pertactine ont considérablement augmenté La montée rapide des souches mutantes dans notre étude de Philadelphie et dans les études nationales de surveillance aux États-Unis et en Australie tous les deux dans les épidémies d’État, par exemple, l’État de Washington en et à l’échelle nationale. partager la caractéristique commune de l’occurrence seulement pendant l’utilisation exclusive des vaccins anticoquelucheux acellulairesNotre collection relativement petite d’isolats déficients en pertactine Ces données suggèrent que la B pertussis déficient en pertactine est apparue comme de multiples événements génétiques, plutôt que par l’expansion clonale d’un seul ou de quelques mutants. Une telle diversité a également été démontrée par de nombreux types de PFGE. La production hôte d’anticorps anti-pertactine est singulièrement cruciale pour la phagocytose accrue de la coqueluche B productrice de pertactine Dans les essais d’efficacité des vaccins, la coqueluche acellulaire Cependant, dans une étude américaine rétrospective, Martin et coll. ont noté que les patients qui avaient reçu la dose ≥ de vaccin anticoquelucheux présentaient un rapport de cotes corrigé de%. intervalle de confiance, – pour avoir un isolat déficient en pertactine, suggérant Mooi et al et Clark ont proposé des explications intégrées pour le déficit des vaccins acellulaires actuels, qui incluent les contributions de l’hôte et du pathogène troubles des règles. La diminution de la réponse lymphocytaire T auxiliaire après les vaccins acellulaires, comparée à celle des La réponse lymphocytaire après des vaccins à cellules entières conduit probablement à une gamme d’anticorps robustes mais étroits avec une faible immunité à médiation cellulaire et une sensibilité accrue à l’infection car les anticorps diminuent après DTaP et Tdap [, -] Adaptation allélique continue de B pertussis. La présente étude démontre l’importance d’obtenir des isolats de culture chez les patients, même lorsque l’identification moléculaire augmente le diagnostic. Séquençage de la région codante de la pertactine entière, plutôt que la recherche ciblée de mutations connues dans le prn gène, était essentiel à la découverte des souches mutantes Notre étude a des sous-marins des forces, y compris la collecte d’isolats au cours des années qui représentent% des cas diagnostiqués dans une cohorte jeune non prédominante, et l’utilisation du séquençage du gène de la pertactine pour identifier les mutations conduisant à une déficience. ceux de nos seuls cas mortels au cours de la période d’étude, et le petit nombre de cas Aucune des mères de notre étude n’a reçu le vaccin Tdap pendant la grossesse, probablement en raison de la relative nouveauté des recommandations Tdap pour les femmes enceintes aux États-Unis. La forte prévalence et la pleine manifestation de la B pertussis chez les jeunes nourrissons soulignent l’urgence de la mise en œuvre de la recommandation actuelle d’immunisation au cours de la dernière grossesse pour fournir des niveaux élevés d’anticorps vaccinaux par voie transplacentaire, en particulier contre la coqueluche, pour protéger contre la maladie. à travers le premier mont très vulnérable hs de vie

Remarque

Conflits d’intérêts potentiels A M Q est un employé salarié de Janssen, Research & amp; Développement Tous les autres auteurs ne signalent aucun conflit potentiel Tous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits d’intérêts potentiels Conflits que les éditeurs considèrent pertinents pour le contenu du manuscrit ont été divulgués