Inhibiteurs de la cétohexokinase: découverte de pyrimidinopyrimidines avec une substitution spécifique complétant le site de fixation de l’ATP

Le diabète sucré non insulinodépendant (NIDDM), caractérisé par une hyperglycémie et une résistance à l’insuline, est souvent accompagné par l’obésité et les maladies cardiovasculaires.1 − 3 Il existe une corrélation positive marquée entre l’apport énergétique accru sous la forme de sucres hautement raffinés et la prévalence du DNID et de l’obésité.4 Les régimes riches en fructose favorisent diverses perturbations métaboliques chez les modèles animaux, De plus, chez les humains en surpoids, la consommation à long terme de fructose augmente l’apport énergétique, le poids corporel, la masse grasse, la pression artérielle et les triglycérides plasmatiques. 10,11 L’ingestion excessive de fructose stimule la lipogenèse de novo par la régulation à la hausse de l’expression des gènes, 12,13 favorise la ré-estérification des acides gras, et augmente la production Les régimes chroniques à haute teneur en fructose augmentent les acides gras libres et les triglycérides, ce qui nuit à l’utilisation du glucose dans le tissu musculaire et augmente le taux de lipolyse dans le tissu adipeux14. Les triglycérides élevés peuvent entraver les voies de signalisation de l’insuline. En outre, 17 soutiennent l’inflammation chronique, 18 et conduisent à la toxicité des glucolipides21 avec une possible défaillance des cellules pancréatiques.22 Le fluor est facilement absorbé par l’alimentation et rapidement métabolisé dans le foie par la fructokinase, également connue sous forme de cétohexokinase (KHK; EC 2.7.1.3) .1 L’enzyme hépatique KHK phosphoryle le fructose en position C1 à l’aide d’adénosine 5 -triphosphate (ATP) pour donner le fructose-1-phosphate (F1P) qui entre dans les voies métaboliques normales.23 &#x02212 ; 23c Cependant, contrairement à la régulation stricte des voies de glucose, le métabolisme du fructose manque de mécanismes de contrôle robustes.14 KHK a une KM élevée, n’est pas inhibée par le produit et n’est pas régulée de façon allostérique.24 En conséquence, de fortes concentrations de fructose Dans ce contexte, le ciblage du métabolisme du fructose par l’inhibition du KHK devrait réduire le poids corporel, les acides gras libres et les triglycérides, offrant ainsi une nouvelle approche pour traiter le NIDDM et l’obésité au sein de la modernité. Il existe une validation génétique humaine de KHK en tant que cible thérapeutique sur la base des mutations qui causent la fructosurie essentielle, un trouble autosomique récessif. son état bénin a des isoformes inactives du KHK hépatique, de sorte que l’ingestion de fructose, de saccharose ou de sorbitol entraîne une augmentation persistante des taux sanguins de fructose et une augmentation de l’excrétion du fructose dans l’urine. Ainsi, un inhibiteur de KHK éliminerait l’excès de glucides sans problème d’innocuité basé sur le mécanisme. Ici, nous rapportons de puissants inhibiteurs sélectifs du KHK hépatique humain (KHK-C isoform25 et 26d), qui fonctionnent en s’ancrant dans le site de liaison de l’ATP. . En utilisant une combinaison de criblage à haut débit (HTS) et de conception de médicaments basée sur la structure, nous avons découvert et optimisé une série de pyrimidinopyrimidines (1). Nous avons également obtenu des structures de cristalloïdes rayons X de KHK, sous forme de pseudohomodimère (sous-unités a et b) avec chaque sous-unité occupée par un ligand inhibiteur, illustrant ainsi les principales interactions intermoléculaires.Tableau 1Structures et KHK Inhibition Results for Derivatives of 1 avec variation de R1 l’activité de KHK peut être évaluée in vitro avec un essai enzymatique couplé à la pyruvate oxydase, 23a mais cette approche de criblage des inhibiteurs n’est pas facilement adaptable à un protocole HTS. Bien que nous ayons développé un test ThermoFluor27 pour évaluer la liaison directe du ligand au KHK, nous avons choisi de mener une campagne HTS en utilisant un test de polarisation de fluorescence (FP) pour mesurer le cours de la réaction enzymatique. Nous avons utilisé le test ADP de transcétreur, qui est une méthode compétitive homogène qui détecte spécifiquement l’adénosine (ADP), un produit de réaction KHK primaire, 28 conjointement avec KHK-C qui a été exprimé par recombinaison et purifié jusqu’à homogénéité. 25,26c, 26d, 29a, 29b Notre campagne HTS impliquant ca. 800   000 composés, avec une large gamme de structures, ont donné plusieurs chémotypes comme points de départ possibles de la découverte de médicaments. La série de pyrimidino [5,4-d] pyrimidine 1 était une voie prometteuse pour l’exploration, car plusieurs composés représentatifs étaient déjà disponibles dans un projet antérieur d’amélioration de la bibliothèque chimique.30 Le succès confirmé 2, avec une valeur IC50 de 400 nM, a servi une base pour une étude plus approfondie. Le groupe initial de hits confirmés a révélé que le NH-cyclopropylméthyle était l’un des meilleurs groupes pour NR2, avec l’analogue 3 ayant une valeur IC50 de 210 nM. Le composé correspondant dépourvu de groupe 2-méthyle (4) avait une CI50 de 3200 nM, et le congénère de 3-méthyle 5 avait une CI50 de 2800 nM (tableau 1).Pour préparer des analogues pour l’étude biologique, y compris les quantités de gramme, nous avons utilisé une voie de synthèse générale, illustrée pour 3 (Schéma 1) .30 Trichloro intermédiaire III clé, de chloration de II, a réagi avec des substrats aminés pour introduire des groupes dans le R1 , R2 et R3 sites séquentiellement (III → IV → V ​​→ VI). Le groupe protecteur Boc dans VI a été éliminé avec CF3CO2H pour donner le produit final 3.Scheme 1Synthesis de 3Thus, nous avons préparé un ensemble d’analogues proches de 3 (Tableau 1; 6 – 21) et obtenu une puissance particulièrement impressionnante avec le 2-methylthio groupe (8; IC50 = 12 nM). Les dérivés avec R1 variés (Tableau 1) ont servi à définir une structure préliminaire – relation d’activité (SAR). Il est évident à partir de cet ensemble de composés qu’un substituant ortho approprié est important pour une inhibition puissante de KHK (voir 3 – 8, 8 – 10 et 17 – 19) et que la taille de ce groupe est cruciale. , avec le volume stérique étant une limitation sérieuse (voir 8, 12, 3, 14, 16 et 17 – 19). Alors que le 2-SMe (8) était un substituant idéal, des groupes de taille modérée, tels que Me (3), Br (19), MeO (6), EtO (7) et Et (14), ont donné des valeurs IC50 # x02013; 200 nM. Il apparaît également que les groupes avec un fort champ électrostatique sont moins favorables (17 et 18 contre 19). Avec le groupe 2-méthyle maintenu constant dans R1, nous avons sondé les effets de la modification de R2 et R3 (tableau 2). Ces résultats indiquent que le groupe R2 peut varier considérablement en taille et en type (2, 3 et 22 – 29); cependant, les grands groupes alkyle (23 et 24) et les disubstitutions (25) sont défavorisés. Pour R3, les groupes portant NH2 + ou NH3 + sont favorisés (cf 3 et 30 – 35). Des analogues de 8 ont ensuite été examinés pour affiner la puissance inhibitrice de KHK pour avancer vers d’autres études (Tableau 3). Plusieurs composés avaient des valeurs de CI50 de 50 nM (36 et 47), et en plus de 8, les composés 36, 38, 40 et 43, 45 et 47 avaient des valeurs IC50 de 20 nM. Ces résultats supportent l’idée, comme noté ci-dessus, que R2 peut varier considérablement en taille et en type et que R3 peut bénéficier d’un groupe ammonium avec plus d’un proton (NH2 + ou NH3 +) (voir 8 et 50, 45 et 49) . En outre, R3 peut tolérer la contrainte conformationnelle (voir 8 et 47) .Tableau 2Structures et résultats d’inhibition KHK pour les analogues de 3 avec variation de R2 et R3Table 3Structures et résultats d’inhibition KHK pour les analogues de 7 avec variation de R2 et R3We KHK &#x02013 ; les complexes de ligands par cristallographie aux rayons X pour acquérir une compréhension des interactions intermoléculaires clés.31 − 31c Les structures de co- cristal de rayons X pour 3 · KHK (résolution de 2,8 Å) et 8 · KHK ( 2.8 Å) a montré que le ligand (3 ou 8) était présent dans chaque site de liaison ATP du pseudohomodimère KHK (sous-unités a et b) .32 Considérant la sous-unité a, il y a une interaction notable entre les protéines et les ligands. médiée par une molécule d’eau conservée, qui se lie à l’azote de l’anneau N3 (viz 1) du ligand et Phe-245 N α de KHK. Le groupe o-tolyle occupe une région hydrophobe qui est largement définie par Phe-260, et la pipérazine NH2 + interagit avec un groupe carboxylate de Asp-27 dans KHK-b (“ Asp-27B ” # x200B; (Figures11 et ​ et2) .2). Pour les deux structures, les distances pour les deux liaisons H clés, N3 / eau oxygène et pipérazine azote / Asp-27 O & spplus, étaient respectivement de 3,1 et 2,8 &#x000c5 ;, (Figure 1). 1). Nous suggérons que la puissance accrue pour 8 peut se rapporter au groupe MeS étant en mesure d’interagir de manière optimale avec une fente ou un patch hydrophobe sur la surface de l’enzyme, à proximité de Phe-260. Nous avons aussi obtenu une structure de cocristaux pour 47 · KHK (2.7 Å). Les sous-unités a et b avec 47 dans le site de liaison ATP sont affichées sur la figure ​ Dans la sous-unité a, l’azote terminal de la spiro-bis-azétidine est lié à l’hydrogène avec Asp-27B (3.1 Å) et Asn-107 (2.9 Å) (figure S1 dans l’information de support), tandis que cette interaction est absente dans la sous-unité b à cause de son “ open ” conformation (figure ​ (figure 33) .26cFigure 1Crystal structure du complexe KHK 8 · Vue de 8 (modèle de bâton: C, vert, N, bleu et S, jaune) et voisins KHK (étiquetés) en sous-unité a (modèles de bâtonnets: C, blanc, N, bleu, O, rouge et S, jaune) et Asp-27 dans la sous-unité b (“ Asp-27B ”) … Figure 2Cristal structure of le complexe KHK 3 · Vue de 3 (modèle de bâtonnet: C, vert et N, bleu) dans la poche de liaison de l’ATP KHK de la sous-unité a (modèle de surface Connelly: gris pour sous-unité a et bleu clair pour sous-unité b Le groupe cyclopropyle s’étend au-delà … Figure 3: Structure cristalline du complexe KHK de 47 · Vue de 47 (modèle de bâtonnet: C, vert, N, bleu et S, jaune) dans la poche de liaison de l’ATP de la sous-unité a (panneau de gauche, modèle de surface Connelly, gris, Asp-27B, bleu clair) et sous-unité b (panneau de droite …Certains composés avec une inhibition puissante de KHK ont été étudiés dans un test cellulaire qui a mesuré le taux de F1H du produit KHK dans des lysats cellulaires en utilisant la LC-MS pour quantifier F1P (Tableau 4) .34 Composés 8, 38, 40 – ont manifesté une inhibition KHK cellulaire raisonnablement puissante (IC50 < 500 nM), qui concerne leur puissance intrinsèque par rapport à KHK et leur capacité à pénétrer dans les cellules. Le composé 42 est remarquable compte tenu de sa valeur CI50 inférieure à 100 nM. Le résultat d'inhibition cellulaire beaucoup plus faible pour 3 vs 8 est compatible avec les puissances KHK relatives (valeurs IC50 de 210 et 12 nM, respectivement). Tableau 4 Résultats fonctionnels cellulaires Le composé 8 a été examiné dans un panel divers de 31 protéines kinases, représentant différentes familles, pour l'inhibition de la kinase hors cible à une concentration de 10 μ M (Invitrogen; avec 100 μ M ATP) .35 Aucune des 31 kinases n'a été inhibée > 40% à cette concentration élevée de 8 ( IC50 ≫ 10 μ M pour 31 kinases). Pour trois kinases métaboliques non ciblées, la ribokinase, l’hexokinase et l’adénosine kinase, la sélectivité de 8 s’est révélée être au moins 50 fois (par rapport à l’inhibition de KHK) .36,37Le composé 8 a une solubilité utile (par exemple, 1,5 mg / mL dans une solution aqueuse à 10% de Solutol), un taux acceptable de D5.0 de 2,9 et des données favorables de perméabilité des cellules CaCO-2 (× 10 – 6 cm / s: A → B, 0,3; B → A, 1,0). Il était stable dans les préparations de microsomes hépatiques humains et de rat (88 et 72% restants à 10 min) et n’inhibait pas significativement les cytochromes P450 des microsomes hépatiques humains (1A2, 2C19, 2D6, 2C9 et 3A4). Le composé 8 présentait une biodisponibilité orale raisonnable chez le rat (F = 34%, t1 / 2 orale = 4 h), mais il avait un volume de distribution élevé (Vdss = 32 L / kg) et un fort taux de clairance (CL = 160 mL). Ainsi, à une dose orale de 10 mg / kg, sa Cmax plasmatique était juste de 0,16 μ M.39En conclusion, nous avons identifié des inhibiteurs puissants et sélectifs de la cétohexokinase humaine (isoforme KHK-C) en vertu d’une nouvelle série de composés de pyrimidinopyrimidine (à savoir 1) calcul. Un test in vitro basé sur la détection directe de l’ADP était très utile pour développer le SAR. Par une substitution appropriée du noyau hétérocyclique, nous avons obtenu des inhibiteurs à faible nanomolaire qui opèrent par amarrage dans la poche de liaison à l’ATP de KHK. Le composé 8 (CI50 = 12 nM) était efficace dans un test fonctionnel cellulaire (CI50 = 400 nM) et était biodisponible par voie orale chez les rats (F = 34%). Nos structures de co-cristal de rayons X de 3 · KHK, 8 · KHK et 47 · KHK présentent les interactions intermoléculaires importantes entre le pharmacophore du ligand et l’enzyme. La disponibilité d’inhibiteurs puissants et sélectifs du KHK devrait faciliter les futures études concernant le rôle du fructose sur la fonction métabolique chez les animaux normaux et dans les modèles de maladies.