Escherichia coli: associations cliniques distinctes avec la phylogénie bactérienne et les caractères de virulence et l’évolution inférée des agents pathogènes dans l’hôte

Contexte Attachant et effaçant Escherichia coli AEEC dépourvu des gènes de la toxine Shiga stx et le facteur d’adhérence E coli entéropathogène EAF plasmide stx- / EAF- sont classés comme E coli entéropathogène atypique et causer de la diarrhée dans le monde entier Cependant, on ignore s’il existe des lignées bactériennes spécifiques. Nous avons comparé stex- / EAF-AEEC récupérés chez des patients principalement atteints de diarrhée sanglante et non-sanglante. Des méthodes stx- / EAF-AEEC ont été isolées par hybridation eae colony blot et ont été sérotypées, testées par amplification en chaîne par polymérase pour des gènes putatifs de virulence, et analysées pour Relations phylogénétiques par typage de séquences multilocusRésultats Au cours de la période 1995-2007, stx- / EAF-AEEC ont été isolés comme étant les seuls pathogènes bactériens provenant de selles provenant de 18 153% des 118 patients atteints de diarrhée sanglante et de 141 13% des 10 550 patients avec diarrhée non sanglante P & lt; 001 Toutes les souches retrouvées chez des patients atteints de diarrhée sanglante, sauf 1, ressemblaient à E. coli EHEC entérohémorragique sur la base de sérotypes, de profils de virulence non stx et de séquences multilocus. En revanche, la plupart des 759% des 141 EA / EAF-AEEC Les patients atteints de diarrhée non sanglante appartenaient à d’autres sérotypes et différaient des autres souches phylogénétiquement et en ce qui concerne les gènes de virulence Trois des 18 patients atteints de diarrhée sanglante et aucun des 141 patients atteints de diarrhée non sanglante ayant perdu leur stœcocytose ou leucémie hémolytique urémique. EHEC-EAF associé à la diarrhée sanglante sont vraisemblablement EHEC qui a perdu la toxine Shiga pendant l’infection EHEC-LST Pour prévenir les complications graves de ces infections, des stratégies de diagnostic indépendantes de la toxine Shiga pour identifier précisément et rapidement de tels patients doivent être développées et appliquées. a le potentiel de distinguer l’EHEC-LST d’un AEX moins pathogène / EAF-AEEC

La fixation et l’effacement des souches Escherichia coli AEEC provoquent une lésion intestinale typique caractérisée par une adhérence intime des bactéries à l’épithélium. Ceci est associé à la destruction des microvillosités et à la réorganisation de l’actine cytosquelettique conduisant à la formation de piédestaux riches en actine. pour l’attachement intime est l’intimine, une protéine membranaire externe codée par eae [1] Sur la base de la présence de déterminants de virulence supplémentaires et de l’issue clinique typique de l’infection, AEEC peut être analysé en 2 groupes principaux: E coli entérohémorragique EHEC et entéropathogène E coli EPEC EHEC du sérotype O157: H7 / NM non serotile et plusieurs sérotypes non-O157 sont des causes majeures de diarrhée sanglante et de syndrome hémolytique et urémique HUS [2, 3], principale cause d’insuffisance rénale aiguë chez l’enfant Les principaux déterminants de la virulence de l’EHEC dans les lésions endothéliales microvasculaires sous-jacentes HUS sont les toxines Shiga codées par les gènes stx portés par les phages [4] Contrairement à E HEC, EPEC manquent stx et provoquent la diarrhée non sanglante [1, 5, 6] « EPEC » typique, en plus de eae, le plasmide EAF facteur d’adhérence EPEC [1, 5], qui héberge bfpA, codant la sous-unité structurelle de bundle- formation de pili qui induit une adhérence localisée aux cellules épithéliales en culture Un sous-ensemble d’EPEC dépourvu du plasmide EAF a été qualifié de EPEC « atypique » EPEP [1, 5] EPEC et aEPEC diffèrent en ce qui concerne les sérotypes, l’épidémiologie et la distribution géographique [5] EPEC typique appartiennent à un spectre limité de sérotypes bien définis [5], tandis que aEPEC englobe un large spectre de sérotypes habituellement non-EPEC qui peuvent varier géographiquement [5-11] Bien que les EPEC typiques sont une cause majeure de diarrhée infantile dans les pays en développement [5], aEPEC ont émergé comme causes de diarrhée chez les enfants du monde entier [5-15] et ont été associés à des cas sporadiques [16] et à des poussées [17] de diarrhée chez les adultes malgré l’importance croissante de stx-négatives, EAF- n EEG- / EAF-AEEC, qui sont classés comme EPEP, on ne sait pas si les membres de ce groupe hétérogène diffèrent dans le potentiel de virulence et, par conséquent, si des lignées particulières peuvent causer une maladie plus grave Pour obtenir un aperçu plus approfondi de cette question, nous comparé stex- / EAF-AEEC récupéré des patients atteints de diarrhée sanglante avec ceux récupérés chez les patients atteints de diarrhée non sanglante, en mettant l’accent sur les sérotypes, les caractéristiques de virulence putatif, et la phylogénie

PATIENTS ET MÉTHODES

Définitions des patients et des cas Lors d’analyses diagnostiques de routine réalisées entre janvier 1995 et juin 2007, des échantillons de selles prélevés sur 10 668 patients épidémiologiquement non apparentés avec diarrhée 1 échantillon par patient ont été étudiés pour détecter la présence de stéroïdes indicatif. 9000 patients ont été hospitalisés Des informations sur la fréquence des selles, la consistance des selles et la présence de sang dans les selles ont été obtenues auprès des médecins traitants ou des parents à l’aide d’un questionnaire standardisé. Le sang visible dans les selles a également été noté lors de l’analyse microbiologique; Diarrhée a été classée comme sanglante si du sang visible a été noté dans les selles Selon ces définitions de cas, 118 patients ont présenté une diarrhée sanglante et 10 550 ont présenté une diarrhée non sanglante. La progression vers le SHU a été déterminée sur la base du développement de l’hématocrite hémolytique microangiopathique hématocrite, <30%, avec des signes périphériques d'hémolyse intravasculaire, thrombocytopénie plaquettaire, <150 000 plaquettes / mm3, et une insuffisance rénale définie comme une concentration sérique de créatinine supérieure à [18] Isolement ofstx-AEEC de stoolsstx-AEEC ont été isolés comme décrit ailleurs [19, 20] En bref, les cultures de bouillon d'enrichissement de bouillon cultivées pendant une nuit sur sorbitol MacConkey agar Oxoid et enterohemolysin agar Sifin ont été examinés pour eae, stx1 et stx2 par PCR eae-Positive colonies ont été isolées de eae-positif, mais s Des échantillons de selles tx par hybridation par transfert de colonies avec une sonde EAE E coli O157 ont été isolés de cultures en bouillon par enrichissement par séparation immunomagnétique avec des anti-E coli O157 Dynabeads Dynal Biotech ASA, culture des billes sur sorbitol MacConkey agar et céfixime gélose MacConkey -tellurite-sorbitol et agglutination sur lame de colonies sorbitol-négatives dans le sérum anti-O157 ou hybridation par transfert de colonies eae Méthodes de phénotypage Les isolats ont été confirmés comme étant E. coli avec utilisation de l'API 20 E; bioMérieux, et les sérotypes ont été déterminés [19] avec des antisérums contre les antigènes E coli O 1-181 et antigènes H 1-56 La fermentation du sorbitol a été détectée sur sorbitol MacConkey agar, la production d'hémolysine EHEC a été détectée sur gélose enterohemolysin, et la résistance au tellurite a été détectée sur agar céfixime-tellurite-sorbitol MacConkey [21] Les toxines Shiga et la toxine cytoléthale distensive ont été détectées à l'aide de cellules Vero [22] et de cellules ovariennes de hamster chinois [23], respectivement. Caractérisation génétique Le plasmide EAF, bfpA, eae, actuellement connu stx allèles [3], les gènes codant pour un panel d'autres toxines et adhésines, le groupe de gènes ter, et les gènes de l'île OI-122 de EHEC O157: H7 souche EDL933 tableau 1 ont été détectés par PCR [19-21, 23-29] Les gènes fliC codant pour la sous-unité de la flagelline ont été sous-typés [30] Le statut intact ou occupé des sites d'intégration sty-phage yehV, wrbA et yecE a été étudié par PCR [31, 32], et les résultats confirmés par séquençage des amplicons [ 31 ] Typage de séquence multilocus MLST Des fragments internes de 7 gènes de ménage adk, fumC, gyrB, icd, mdh, purA et recA ont été analysés, et les relations génétiques entre différents types de séquences ont été attribuées conformément au site Web EMLi MLST [http: / / webmpiib-berlinmpgde / mlst / dbs / Ecoli] ont été déterminées comme décrit ailleurs [29] Les analyses phylogénétiques étaient basées sur l'algorithme de BURST [33], qui regroupe des souches partageant ⩾6 allèles identiques dans le même complexe clonal. généré à l'aide de l'outil Web d'analyse http: // pubmlstorg / analy sis / Détection d'autres pathogènes bactériens dans les échantillons de selles La présence d'espèces de Salmonella, d'espèces Shigella, d'espèces Yersinia, de Campylobacter jejuni et d'EHEC a été évaluée [29] Le test χ2, le test Y2 corrigé de Yates, et EpiInfo, version 2002 des Centers for Disease Control and Prevention, Organisation mondiale de la Santé, ont été utilisés pour l'analyse statistique. considéré comme statistiquement significatif

RÉSULTATS

des gènes de virulence putatifs ont été trouvés dans 115 723% des 159 isolats d’EEAE stx / EAF; ces 115 souches appartenaient à 41 sérotypes ou ne pouvaient pas être entièrement typées tables 1 et 3 Le spectre des gènes putatifs de virulence différait dans les souches de différents sérotypes tableaux 1 et 3 Tous stx- / EAF-AEEC des sérotypes O26: H11 / NM, O103 : H2 / NM, O111: NM, O121: H19, O145: H28 / NM et O157: NM, qui étaient significativement associés à une diarrhée sanglante, possédaient EHEC-hlyA, codant pour l’hémolysine EHEC; diverses combinaisons d’adhésines, principalement sérotypiques; et l’OI-122 de EHEC O157: H7 souche EDL933, soit complète efa1, sen, nleB, nleE, et pagC ou sans pagC tableau 1 Les profils de virulence de ces souches étaient, sauf pour l’absence de gènes stx, identiques à ceux de EHEC des sérotypes correspondants isolés de patients atteints de diarrhée sanglante dans notre étude précédente [22] tableau 1 La même chose était vraie pour la souche unique de sérotype O157: H7 données non montrées st / EAF-AEEC des autres sérotypes qui étaient, avec une seule exception, trouvée uniquement chez les patients atteints de diarrhée non sanglante Tableau 2 – étaient très hétérogènes dans leurs profils de virulence Tableau 3 En tant que groupe, ils possédaient moins souvent des gènes de virulence putatifs identifiés dans des souches associées à une diarrhée sanglante. , codant l’adhésine de Paa associée à l’attachement et à l’effacement des porcs, décrite à l’origine dans l’EPEC porcine [24]. Certains de ces isolats portaient des locus qui n’étaient pas présents dans les souches associées à la diarrhée sanglante. 7 isolats de 5 sérotypes différents contenant astA, codant l’entérotoxine thermo-stable entéro-agrégative E coli, et 6 isolats possédaient des agrégats de cdt codant cytotoxhal distendant la toxine I ou cytotoxique distendant la toxine II; Dans 2 de ces isolats, le cdt était le seul déterminant putatif de la virulence identifié en dehors de l’analyse des sites d’intégration stx-phage. Chacune des 20 souches stx- / EAF-AEEC O26: H11 / NM et 11 stx- / EAF-AEEC O157: H7 / NM avaient des locus génomiques intacts qui sont connus pour servir de sites d’intégration pour les bactériophages stx-convertis dans EHEC O157: H7 / NM yehV, wrbA et yecE [32, 36] et EHEC O26: H11 / NM wrbA et yecE [31] Ainsi, l’absence de gènes stx dans AEEC O26 et O157 était associée à l’absence de phages stx-portants de leurs chromosomesPhenotypes Sorbitol a été fermenté par 143 899% de 159 stx- / EAF- AEEC Les 16 fermenteurs non-sorbitol appartenaient aux sérotypes O132: H34 3 souches, O145: H34 3 souches, O145: H28 2 souches, O49: NM, O63: H6, O85: NM, O115: H8, O157: H7, ONT: H31, ONT: HNT, et Orough: H6 1 souche chacun Cinquante-quatre 340% des 159 souches étaient résistantes au tellurite, comme en témoigne leur capacité à croître sur gélose de céfixime-tellurite-sorbitol MacConkey; la résistance à la tellurite était corrélée à la présence du groupe de gènes ter et était restreinte aux souches des sérotypes particuliers tableaux 1 et 3 Aucune des souches produites Shiga toxines EHEC hémolysine n’était produite par 62 des 72 souches hébergeant EHEC-hlyA; les 10 souches qui n’exprimaient pas le phénotype entérohémolytique étaient E. coli O157: NM fermentant le sorbitol. La toxine cytotoxique distillante était exprimée par toutes les souches de 16 souches contenant du cdt, 1: 4-1: 16; médiane, 1: 8MLML analyse MLST a été réalisée avec 115 stx- / EAF-AEEC qui contenait au moins 1 types de séquences non-eae déterminants de virulence et les complexes clonaux sont présentés dans les tableaux 1 et 3, 19 isolats EHEC récupérés chez les patients souffrant de diarrhée sanglante Tableau 1, et 2 isolats EPEC typiques utilisés pour la comparaison Tous les AEEC stx- / EAF- appartenant aux sérotypes E26 de l’ECEH: H11 / NM, O103: H2 / NM, O111: NM, O121: H19, O145: H28 / NM et O157 : H7 / NM partage avec EHEC des sérotypes correspondants le même type de séquence ou au moins 6 des 7 allèles étudiés; par conséquent, ils ont été regroupés dans le même complexe clonal figure 1 et le tableau 1 La seule exception était un stx- / EAF-AEEC O111: NM fliCH8; ST381, CC590, qui ne partageaient que 4 allèles avec EHEC O111: H8 CC29 figure 1 Les complexes clonaux qui comprenaient EHEC et stx- / EAF-AEEC associés à une diarrhée sanglante ne contenaient que rarement des EAE stx- / EAF d’autres sérotypes figure 1 et tableau 3 Comme prévu, un stx- / EAF-AEEC O55: H7, un progéniteur proposé de EHEC O157, regroupés avec stx- / EAF-AEEC et EHEC O157 dans CC11 figure 1 et les tableaux 1 et 3 En outre, un stx- / EAF- AEEC O121: NM ST800 était seulement un variant locus simple de EHEC et stx- / EAF- AEEC O121: H19 ST655 figure 1 En revanche, la majorité des isolats stx- / EAF-AEEC récupérés seulement chez les patients atteints de diarrhée non sanglante tableau 3 étaient Ces souches ont été regroupées par MLST en 7 complexes clonaux CC10, CC28, CC122, CC165, CC206, CC278 et CC582 et 22 singletons Figure 1 Les 2 souches EPEC typiques , y compris le seul EPEC typique isolé dans notre étude O125: NM; ST299 et le prototype EPEC souche 2348/69 O127: H6; ST15, n’étaient que marginalement apparentés à toutes les souches stx- / EAF-AEEC, soulignant l’hétérogénéité de stex- AEEC figure 1

DISCUSSION

HUS [19, 31, 32] et désignées telles souches EHECLST c.-à-d. « EHEC qui a perdu la toxine de Shiga » [29] Parce que la diarrhée sanglante précède généralement le HUS associé à l’EHEC [2, 34], il est plausible que Un tel scénario expliquerait le développement du SHU chez les patients atteints de diarrhée sanglante qui ont éliminé l’AEX stx- / EAF comme seul agent pathogène. Le mécanisme le plus probable de perte de stx, qui est le plus probable. implique l’excision de bactériophages stx-convertis du génome EHEC [4, 31, 32], est soutenu par notre constatation que loci chromosomiques qui sont des sites d’intégration connus pour les bactériophages stx-convertis dans EHEC O157: H7 / NM [32, 36] et EHEC O26: H11 / NM [31] étaient intacts dans les EEE-ECE-ECE stx- / EAF des sérotypes correspondants Cependant, nous ne disposons pas de données suffisantes sur la thérapie du patient pour déterminer si les antibiotiques – un des stimuli qui peuvent induire le excision des stx-phages des chromosomes EHEC [4, 36] – peut avoir joué un rôle dans la perte de stx chez ces patients Nous ne pouvons pas non plus déterminer les points temporels de la maladie lorsque la perte stx est plus précise, sauf qu’elle a probablement eu lieu entre le début de la diarrhée et les jours 5-9 après l’apparition, lorsque des échantillons de selles provenant de patients atteints de diarrhée sanglante ont été prélevés pour analyse microbiologique Il est également possible que certaines de ces souches aient perdu leurs effets in vitro, lors du traitement des selles ou de la culture, comme cela a été observé par ailleurs [31] AEEC comprend des souches qui diffèrent de l’EHEC-LST putatif phylogénétiquement, sur la base du spectre des sérotypes et des déterminants de virulence, et qui sont associés à la diarrhée non sanglante Des souches présentant des caractéristiques similaires ont été isolées chez des patients atteints de diarrhée non sanglante dans le monde entier [6, 8, 10, 37] et, par conséquent, représentent apparemment «vrais» aEPEC Ces souches appartiennent à de multiples lignées phylogénétiques, comme démontré par leur séparation en complexe 7 clonal s et 22 singletons largement répandus dans la population de E. coli Le fait que la plupart des souches aEPEC moins pathogènes puissent être distinguées de l’EHEC-LST par l’utilisation du MLST s’accorde avec un récent rapport de Ziebell et al [38], qui ont appliqué le MLST aux E. coli productrices de shigatoxines et à l’EHEC différenciée qui causent le SHU de souches moins pathogènes, c’est-à-dire celles qui causent la diarrhée ou des souches non pathogènes Ainsi, en général, la MLST est un outil puissant pour déterminer l’importance des AEEC pour la santé publique. , Ziebell et al [38] ont observé une très bonne corrélation entre l’analyse MLST et le sérotypage, pour distinguer E coli hautement pathogène des pathogènes moins pathogènes, suggérant que les sérotypes sont des marqueurs diagnostiques utiles pour les lignées phylogénétiques associées à des maladies humaines sévères. les souches récupérées chez les patients atteints de diarrhée sanglante qui sont, par définition, aEPEC sont les plus plausibles EHEC-LST a des implications cliniques Bien que la perte stx tôt dans fection, avant que la toxine Shiga soit produite et blesse les cellules hôtes, pourrait arrêter la progression de l’infection au SHU, aucune donnée n’est actuellement disponible pour soutenir cette hypothèse. Par conséquent, tous les patients atteints de diarrhée sanglante qui perdent EHEC-LST devraient être considérés comme Cependant, la mise en œuvre de procédures pouvant bénéficier aux patients atteints de diarrhée à médiation EHEC pour réduire l’insuffisance rénale, comme l’augmentation du volume isotonique [39] et l’évitement du traitement antibiotique [18], est En raison de procédures diagnostiques inadéquates, ces patients ne sont presque jamais identifiés à ce stade de la maladie. Pour ces raisons, les informations cliniques des médecins traitants, par exemple, la nature de la diarrhée et les approches microbiologiques complexes [ 29, 40] sont nécessaires pour identifier rapidement EHEC et EHEC-LST et différencier ce second groupe des autres aEPEC dans les échantillons de selles des patients. les approches comprennent divers protocoles PCR qui ciblent des gènes communs à tous les AEEC, tels que eae [19, 29] ou escV [40], ou des gènes partagés par EHEC et EHEC-LST de sérogroupes particuliers, par exemple, rfbO157, sfpA et wzyO26 [20, 25] Ces procédures sont utiles pour dépister les AEEC dans les échantillons de selles des patients [19, 20, 29, 40] L’isolement des AEEC, quel que soit le pathotype, est réalisé par hybridation eae colony blot [19, 29]. Les lignées phylogénétiques des AEEC sont associées à une diarrhée sanglante, indépendamment de la présence de la toxine Shiga au moment de l’isolement En raison de la progression systémique potentielle de ces infections, des stratégies diagnostiques ciblant les caractéristiques des AEEC indépendantes des toxines Shiga sont nécessaires pour identifier ces patients tôt dans leur vie. maladie MLST combiné avec le sérotypage est un outil puissant pour distinguer STX- / EAF-AEEC avec le potentiel de provoquer une diarrhée sanglante EHEC-LST d’autres souches EPEC atypiques, apparemment moins pathogènes, qui causent diarrhée non sanglante

Reconnaissance

Nous remercions Phillip I Tarr Université de Médecine de l’Université de Washington, pour avoir engagé des discussions fructueuses pendant la préparation du manuscrit, et Nadine Brandt Institut pour l’Hygiène, Université de Münster, pour l’assistance techniqueSupport financier Le Centre Interdisciplinaire de Recherche Clinique Münster Ka2 / 061/04 [à MB et AM] et à Me2 / 023/08, le réseau de l’Union européenne ERA-NET PathoGenoMics 0313937C [à BM], et le réseau d’excellence de l’Union européenne EuroPathoGenomic LSHB-CT- 2005-512061Pots d’intérêt potentiels Tous les auteurs: pas de conflits