Dysbiose qui prévient l’entérocolite nécrosante chez les nourrissons très prématurés

Contexte L’entérocolite nécrosante La NEC est une maladie intestinale inflammatoire dévastatrice chez les prématurés associés à une infection. La NEC suspectée peut être indiscernable de la septicémie et, dans les cas établis, un nourrisson peut mourir dans les heures suivant le diagnostic. Un traitement présymptomatique s’impose Méthodes Les échantillons fécaux et les données cliniques ont été recueillis à partir d’une cohorte de prématurés prématurés. Le séquençage de nouvelle génération des régions du gène de l’ARN ribosomique a été utilisé pour caractériser le microbiote des échantillons fécaux de pré-diagnostic. chez les nouveau-nés avec NEC, avec suspicion NEC, et les contrôles La régression logistique a été utilisée pour déterminer les caractéristiques cliniques et les unités taxonomiques opérationnelles OTU discriminant les cas des contrôles Les échantillons ont été cultivés et les isolats identifiés en utilisant la désorption / ionisation laser assistée par matrice Des isolats de Clostridium ont été typés et des gènes de toxine ont été détectés. Résultats Un OTU clostridial était surabondant dans les échantillons de pré-diagnostic des nourrissons avec NEC établi P Culture confirmait la présence de Clostridium perfringens type A Polymérisation de longueur de fragment amplifiée fluorescente établie qu’aucun isolat n’était identique Prédiagnostic La PPC avec oxygène supplémentaire a également été associée à une augmentation du risque d’ECN. Deux signatures de microbiote fécale OTU de Clostridium et de Klebsiella et besoin d’un signal d’oxygène CPAP prolongé. risque accru d’ECN chez les nourrissons présymptomatiques Ces biomarqueurs aideront au développement d’un outil de dépistage pour permettre un diagnostic très précoce de l’enregistrement des essais cliniques NCT NCT

Entérocolite nécrosante, NEC, microbiote fécal, enfant prématuré Entérocolite nécrosante La NEC est une maladie dévastatrice affectant principalement les prématurés, dont l’incidence augmente avec l’âge gestationnel. Les progrès remarquables des soins intensifs néonataux au cours des dernières décennies ont permis la survie de bébés prématurés et vulnérables. mais avec cela vient une augmentation des cas de NEC NEC a une mortalité élevée – jusqu’à% dans les nourrissons de très faible poids à la naissance & lt; g – et chez les survivants, le dysfonctionnement GI gastro-intestinal et la déficience fonctionnelle peuvent durer toute la vie Une stratégie de surveillance / dépistage est essentielle pour réduire l’impact de cette affection, car le diagnostic rapide de NEC est difficile. Les premiers signes du stade Bell [suspicion NEC] sont indiscernables de l’infection sanguine septicémique Dans les cas où les stades Bell [définis] et [sévères] ont été confirmés, la détérioration clinique peut être si rapide que le nourrisson meurt dans les heures suivant le diagnostic. est utile pour regrouper les signes et les symptômes, il ne traite pas de l’étiologie Malgré & gt; des siècles de recherche , la cause de cette maladie intestinale inflammatoire reste insaisissable, et les stratégies de traitement restent largement favorables et non spécifiquesNEC est considérée comme une maladie multifactorielle nécessitant un intestin immature, les aliments entéraux, et la colonisation bactérienne pour son développement la contribution d’un agent infectieux provient d’épidémies bien documentées ; une association entre l’utilisation empirique d’antibiotiques durant la première semaine de vie et un risque accru de NEC , probablement en raison de la distorsion potentielle du microbiote GI; et l’observation que NEC ne se produit pas dans un contexte gnotobiotique L’expression du récepteur Toll-like sur les entérocytes est nécessaire pour que la maladie se produise , et peut expliquer pourquoi son apparition est inversement proportionnelle à l’âge gestationnel à la naissance. impliquée comme causant NEC, et on pense que la colonisation anormale du tractus gastro-intestinal peut jouer un rôle dans la pathogenèse Ceci a suggéré diverses interventions probiotiques comme stratégies prophylactiques possibles Pour capturer l’évolution du microbiote GI de la naissance dans le nombre relativement petit des nourrissons qui développent NEC, nous avons recueilli presque tous les échantillons fécaux et & gt; Champs de données cliniques journalières de chaque bébé né dans une unité néonatale tertiaire sur site pendant une période Nous avons utilisé l’approche indépendante de la culture offerte par le séquençage de nouvelle génération pour caractériser les microbes sur la base de la variation des domaines de l’ARN ribosomal. gène de l’ARNr En combinaison avec des méthodes supplémentaires, nous avons identifié des signatures significatives associées à la future NEC: caractérisées par une prolifération apparente de Clostridium perfringens, et l’autre dominée par une unité taxonomique opérationnelle de Klebsiella OTU

Méthodes

Population étudiée

Les nourrissons nés avant la fin de la gestation ont été admises à l’unité de soins intensifs néonatals du NICU St Mary’s Hospital, Queen Charlotte’s et Chelsea Hospital entre janvier et décembre, à moins d’être considérées in extremis dans la Les premiers jours de la vie L’USIN est un centre tertiaire avec approximativement des admissions par an Des nourrissons éligibles ont été recrutés Les deux hôpitaux ont des protocoles d’alimentation, antibiotiques et antifongiques identiques, et les membres du personnel tournent entre les sites Les probiotiques et les antagonistes des récepteurs H ne sont pas utilisés. L’information clinique quotidienne détaillée a été recueillie à partir des dossiers des patients

Déclaration d’éthique

L’étude « Définir le microbiote intestinal chez les prématurés » Identifiant ClinicalTrialsgov NCT a été approuvé par West London Research Ethics Committee Deux, Royaume-Uni numéro de référence / H / Parents a donné son consentement éclairé pour leur enfant à participer à l’étude

Collecte d’échantillons

Nous avons recueilli presque chaque échantillon fécal produit par chaque participant depuis le point de recrutement jusqu’à ce que les échantillons soient prélevés par le personnel infirmier à partir de couches à l’aide d’une spatule stérile placée dans un tube Eppendorf stérile, sans ARNase, stérile, stocké dans un congélateur sur l’unité néonatale dans les heures suivant la collecte, et conservé à – ° C en quelques jours

Définition de cas, sélection de contrôle et gestion clinique

Un cas NEC a été défini selon les critères du Vermont Oxford Network et mis en scène selon les critères de stadification modifiés de Bell Le diagnostic a été posé par le consultant néonatal confirmé et confirmé par un néonatalogiste indépendant Trois nourrissons témoins non NEC ou infection sanguine / diagnostic de septicémie Dans la mesure du possible, les nourrissons témoins ont ensuite été appariés selon le mode d’accouchement, l’hôpital d’admission et l’utilisation d’antibiotiques, car ces facteurs sont connus pour influencer le microbiote NEC ont été appariés de la même manière à un seul bébé témoin. En tant que sous-étude distincte, chaque nouveau-né atteint le stade Bell NEC et a été indépendamment associé à un témoin contemporain sur le même site pour étudier la possibilité d’une éclosion.

Extraction d’ADN bactérien

Des échantillons fécaux mg ont été traités en utilisant le kit FastDNA SPIN pour MP Biomedicals Soil, incorporant une étape de battement des billes pour la perturbation mécanique des cellules Nous avons établi que cela lyses efficacement les bactéries Gram positif et négatif dans les échantillons fécaux des données non publiées. protocole du fabricant, sauf que l’étape d’élution finale était en tampon Tris mM à faible teneur en acide éthylènediaminetétraacétique mM

Amplification De La Réaction En Chaîne Polymérase Et Pyroséquençage Des Régions V-V Du Gène De L’ARNr B bactérien

La région V-V des gènes S ARNr bactériens a été amplifiée à partir de chaque échantillon d’ADN en utilisant une paire d’amorces marquées avec des codes-barres de Golay corrigeant les erreurs -pb uniques Polymerase réaction en chaîne PCR a été réalisée comme décrit précédemment. Des amplicons ont été regroupés et purifiés, et des cycles de pyroséquençage ont été effectués sur un Roche Sciences GS FLX Roche suivant le protocole Roche Amplicon Lib-L. Les échantillons répliqués ont été étalés sur toutes les séquences de séquençage. en tant que contrôles internes

Bioinformatique

Les données traitées au Shotgun ont été débruitées en utilisant AmpliconNoise dans le paquet version Quantitative Insights Into Microbial Ecology , suivi de l’élimination des chimères avec ChimeraSlayer Les séquences ont été alignées en utilisant la base de données SILVA rrna SSU_REF utilisation de l’algorithme UCLUST dans les OTU Des séquences représentatives ont été sélectionnées et classées en utilisant le classificateur de projets de base de données ribosomique Une rarefaction a été effectuée, supprimant l’hétérogénéité des lectures de séquençage par échantillon

Analyses statistiques

Les cas et les témoins ont été comparés en utilisant les tests t de Student et les tests Fisher ou le test exact de Fisher lorsque les OTU appropriés qui étaient différentiellement abondants entre NEC et les groupes témoins ont été identifiés en utilisant la régression logistique réalisée avec le modèle linéaire généralisé et l’algorithme pas à pas Les comparaisons des données de comptage OTU ont été effectuées à l’aide des tests t de Student variances inégales P values ​​& lt; ont été considérés comme significatifs

Disponibilité des données

Des données d’amplicons S rRNA ont été déposées à l’European Nucleotide Archive sous le numéro d’accès PRJEB

Culture bactérienne et identification

Un échantillon antécédent congelé aussi proche que possible du jour du diagnostic de NEC D de chaque cas et de leur témoin contemporain correspondant a été sélectionné pour la culture des espèces Clostridium et Enterobacteriaceae. Pour isoler les espèces Clostridium, une méthode de choc alcoolique a été utilisée pour éliminer Des échantillons ont été inoculés sur CHROMagar BD pour faciliter l’identification des Enterobacteriaceae. Tous les isolats bactériens ont été identifiés par désorption / ionisation laser assistée par matrice – temps de vol à l’aide d’un Bruker. Microflex LT Bruker Daltonics

Typage et toxine PCR multiplexée

Des isolats de C perfringens ont été analysés au service de référence des pathogènes alimentaires de Public Health England pour le dépistage de la présence de gènes alpha, bêta, epsilon, iota, cpe et betatoxine en utilisant la PCR multiplexée. la relation des isolats

RÉSULTATS

Les patients

Trois cent soixante-neuf nourrissons ont été recrutés et des échantillons fécaux ont été recueillis. Vingt-huit nourrissons ont développé le NEC pendant la période d’étude: au stade Bell, au stade Bell et au stade Bell. La figure illustre la distribution des cas au cours des années. / n’ont pas été inclus dans l’analyse en raison du manque d’échantillons développés NEC avant d’obtenir le consentement n =, ou des lectures de séquençage inadéquates n = Deux enfants avec stade Bell n’ont pas pu être inclus en raison du manque de contrôles Tableau présente les caractéristiques cliniques de la cohorte Bell / cas analysés, non inclus dans l’analyse et les contrôles Les comparaisons sont montrées entre les cas analysés et, respectivement, non inclus dans l’analyse, et les contrôles Les nourrissons témoins se sont révélés avoir significativement plus de jours sans assistance respiratoire, et un hôpital de naissance différent, de Il n’y avait pas de différences démographiques telles que le poids moyen à la naissance, la gestation à la naissance, l’hôpital de naissance, le l’accouchement, ou l’utilisation d’antibiotiques entre le stade Bell / les nourrissons qui ont été inclus dans l’analyse Au moment de développer le CEN avant d’obtenir le consentement, l’âge moyen au diagnostic était plus faible chez les nourrissons qui n’étaient pas inclus dans l’analyse

Tableau Récapitulatif des caractéristiques des cohortes: Cas d’entérocolite nécrosante Stade Bell / et témoins Cas caractéristiques Analysés n = Cas non analysés n = Témoins n = Démographie Homme Poids moyen à la naissance IQR, g – – – Gestation moyenne à la naissance IQR, semaines jours – – – Âge moyen postnatal à D IQR, d – * – * NA Âge moyen postnatal à l’échantillon le plus proche de D IQR, d – NA – Hôpital de naissance Site A ** ** Site B ** ** Autre ** ** Origine ethnique Noir Blanc Asiatique Race mixte Inconnue Mode d’accouchement Césarienne Vaginale Caractéristiques maternelles Usage IVA maternel lors de l’accouchement PROM maternel Septicémie / chorioamnionite Condition à la naissance Le pH le plus bas enregistré au cours de la première h IQR – – – Le plus faible excédent de base enregistré dans le premier h, IQR – – à – – – – – à – Mean APGAR à min IQR – – – Utilisation intraveineuse d’antibiotiques Nombre moyen de d de IVABb pendant la première semaine de vie IQR – – – Mean Nombre de D cumulatifs de l’utilisation de l’IVABb avant D IQR – – – Régime d’alimentation Moyenne Nombre de D reçus MEBM avant D IQR – – *** – Nombre moyen de d reçus DEBM avant D IQR – – *** – Moyenne Non du lait maternisé reçu avant D IQR – – – Besoin en assistance respiratoire Moyenne Nombre de d nécessitant un support ventilatoire HFOV ou ventilation conventionnelle avant D IQR – – – Moyenne Nombre de d nécessitant CPAP sans oxygène, avant D IQR – – ** * – Nombre moyen de d nécessitant une PPC avec de l’oxygène supplémentaire, avant D IQR – – *** – Nombre moyen de d nécessitant de l’oxygène NP, avant D IQR – – – Nombre moyen de d ne nécessitant aucun support respiratoire, à D IQR – – – Présence de cas caractéristiques de PDA analysés n = cas non analysés n = témoins n = démographiques Homme Poids moyen à la naissance IQR, g – – – Gestation moyenne à la naissance IQR, semaines jours – – – Âge moyen postnatal à D IQR , d – * – * NA Âge moyen postnatal à l’échantillon le plus proche de D IQR, d – NA – Hôpital de naissance Site A ** ** Site B ** ** Autre ** ** Origine ethnique Noir Blanc Asiatique Race mixte Inconnue Mode de livraison Césarienne Vaginale Caractéristiques maternelles Utilisation IVAB maternelle lors de l’accouchement PROM maternelle Maternelle septicémie / chorioamnionite Condition à la naissance Moyenne pH le plus bas enregistré dans la première h IQR – – – Le plus faible excédent de base enregistré dans la première h, IQR – – à – – – à – – à – Mean APGAR à min IQR – – – Utilisation d’antibiotiques intraveineux Nombre moyen de d de IVABb pendant la première semaine de vie IQR – – – Moyenne Nombre de d cumulatifs d’utilisation d’IVABb avant à D IQR – – – Régime d’alimentation Moyenne Nombre de D reçus MEBM avant D IQR – – *** – Nombre moyen de d reçus DEBM avant D IQR – – *** – Nombre moyen de d lait maternisé reçu avant D IQR – – – Besoin en assistance respiratoire Moyenne Nombre de d nécessitant un support ventilatoire HFOV ou ventilation conventionnelle avant D IQR – – – Moyenne Nombre de d nécessitant CPAP sans oxygène, avant D IQR – – *** – Nombre moyen de d nécessitant CPAP avec de l’oxygène supplémentaire, avant D IQR – – *** – Nombre moyen de d nécessitant de l’oxygène NP, avant D IQR – – – Nombre moyen de d ne nécessitant aucun support respiratoire, avant D IQR – – – Présence de PDA Les données sont présentées sous le n °%, sauf indication contraire: specifiedAbbreviations Apgar, apparence, Pulse, Grimace, activité, respiration; PPC, pression positive continue des voies respiratoires; DEBM, lait maternel exprimé par le donneur; D, jour du diagnostic NEC ou âge postnatal du contrôle apparié; VOHF, ventilation à haute fréquence d’oscillation; IQR, intervalle interquartile; IVAB, antibiotiques intraveineux; MEBM, lait maternel exprimé par la mère; NA, non applicable; NP, dent nasale; PDA, brevet ductus artériel; PROM, rupture prolongée des membranesa Valeur la plus basse enregistrée à partir du cordon / capillaire à écoulement libre capillaire / artériel / veineux sanguin IVB de première intention pour suspicion de sepsis précoce: co-amoxiclav, ou benzylpénicilline et gentamicine en cas de transfert ex-utérin; IVAB de deuxième intention: vancomycine et pipéracilline-tazobactam * P = ** P = *** P & lt; : confondu par les nourrissons atteints d’entérocolite nécrosante NEC non inclus dans l’analyse développant systématiquement NEC à un âge postnatal significativement plus jeuneView Large

Figure Vue largeTunale de téléchargement Cas d’entérocolite nécrosante NEC au cours des mois L’éclosion indique le site hospitalier et la stadification de Bell La longueur des barres indique la durée d’admission du nourrisson dans l’unité néonatale et les cercles indiquent la date du diagnostic NEC Les cas d’astérisque ont été exclus des analyses. Données de séquençage n =, ou témoins n = Figure Voir en grandDiffuser des cas d’entérocolite nécrosante NEC pendant des mois Hatching indique le site hospitalier et la stadification de Bell La longueur des barres indique la durée de l’admission du nourrisson sur l’unité néonatale et les cercles indiquent la date du diagnostic. à partir des analyses dues au manque d’échantillons n =, données de séquençage n =, ou contrôles n =

-Pyroséquençage et traitement initial des données

Au moins un échantillon fécal par semaine des nourrissons témoins a été séquencé afin de déterminer le microbiote GI normal. De chaque nourrisson NEC, des échantillons fécaux hebdomadaires prélevés à la naissance et des excréments prélevés dans les semaines précédant D ont été caractérisés Aucune réduction de la fréquence de défécation n’a été observée. Après le débruitage et l’élimination des chimères, les lectures sont restées et ont été démultiplexées. Le nombre moyen de lectures était par échantillon. Les lectures d’échantillons ont été raréfiées, avec des courbes de raréfaction montrant être suffisant pour capturer la diversité de l’UTO, telle que mesurée par l’indice de diversité de Shannon. Figure supplémentaire Les séquences singletonnes présentes une seule fois dans l’ensemble de données et les OTU présentes dans un seul échantillon ont été supprimées

Communautés bactériennes dans des échantillons de contrôle

Les KLEbsiella, Staphylococcus, Enterobacteriaceae, Enterococcus et Bifidobacterium sont les plus abondants. La figure montre la répartition des UTO regroupées par semaine postnatale et mode d’accouchement. Déterminer si les facteurs du jour de l’échantillonnage, du mode d’accouchement et de l’hôpital de naissance doivent être contrôlés par exemple, la régression logistique a été utilisée pour tester les associations, permettant à toutes les variables d’être des facteurs potentiels. Cinq UTO ont été trouvés corrélés avec le temps; il y avait une augmentation de Bifidobacterium et Klebsiella P = et P =, respectivement, et une diminution à la fois Staphylococcus et Staphylococcus et Streptococcus P & lt; , P =, et P = respectivement, l’accouchement vaginal était associé à Enterobacteriaceae et Clostridium OTUs P = et P = respectivement, et l’accouchement par césarienne avec Clostridium P = Une association plus faible a également été observée entre les OTU des Enterobacteriaceae et la naissance à l’extérieur des sites A et BP = Voir la figure supplémentaire pour les données complètes de séquençage

Vue de la figure grandDownload structure de la communauté bactérienne chez les nourrissons témoins par semaine postnatale et mode de livraison Les données ont été générées en utilisant l’échantillon par semaine de bébés contrôles en utilisant le nombre moyen de lectures Quand le même genre d’étiquette descriptive, la famille est attachée à & gt; unité taxonomique opérationnelle OTU; définis par% de similarité de séquence, ceux-ci sont numérotés séquentiellement; Les données ont été générées en utilisant l’échantillon par semaine des nourrissons témoins en utilisant le nombre moyen de lectures Quand le même genre d’étiquette descriptive, la famille est attachée à & gt; unité taxonomique opérationnelle OTU; définis par% de similarité de séquence, ceux-ci sont numérotés séquentiellement; aucun OTU n’est combiné

Communautés bactériennes dans les échantillons NEC

En accord avec d’autres études publiées, nos principales analyses ont été réalisées sur des cas confirmés de stade NEC Bell /; Les cas les plus abondants de NEC ont été analysés séparément. Les OTU les plus abondantes dans les échantillons recueillis les plus proches de D dans NEC Bell stade / cas n = étaient Klebsiella, Clostridium, Staphylococcus et Enterococcus Figure Nous avons cherché des différences dans l’abondance des OTU de ces échantillons. un modèle linéaire pour corriger les facteurs de confusion cliniques Des modèles ont été construits pour chacun des OTU supérieurs% de l’ensemble de données lit pour déterminer si les facteurs cliniques montrés dans le Tableau et / ou le cas / statut de contrôle des échantillons sont corrélés avec les nombres lus le Clostridium de l’OTU était significativement associé aux cas P = mean = lectures dans les cas, chez les témoins Des lectures de hauts niveaux de cet OTU ont également été trouvées chez les nourrissons NEC suspectés et chez leurs témoins

Figure Vue largeTélécharger les communautés bactériennes dans l’entérocolite nécrosante Échantillons NEC prélevés le plus près du jour du diagnostic de NEC D et leurs témoins appariés Les échantillons sont classés le long de l’axe des x L’intensité des couleurs indique le nombre de lectures raréfiées de chaque unité taxonomique opérationnelle OTU trouvé dans un échantillon, comme indiqué par la barre colorée La diversité bactérienne moyenne de communauté n’a pas été trouvée pour différer significativement entre NEC et contrôler les échantillons infantilesFigure View largeTélécharger les communautés bactériennes dans l’entérocolite nécrosante NEC échantillons d’enfants recueillis le plus proche du jour du diagnostic de NEC D, et leur contrôles appariés Les échantillons sont catégorisés le long de l’axe x L’intensité des couleurs indique le nombre de lectures raréfiées de chaque unité taxonomique opérationnelle OTU qui se trouve dans un échantillon, comme indiqué par la barre colorée La diversité bactérienne moyenne des communautés n’a pas été significativement différente entre NEC et NEC. contrôler les échantillons de nourrissons

Analyse de régression logistique

La régression logistique a été utilisée pour identifier les facteurs discriminants entre les échantillons de phase / cas de Bell et les échantillons de contrôlePar analyse univariée incluant comme variables les meilleurs OTU et une gamme de caractéristiques cliniques, nous avons identifié le nombre de lectures de Clostridium OTU et de jours de pression positive continue PPC oxygène comme discriminants significatifs Littridium OTU lit, basé sur le nombre moyen de lectures au stade Bell NEC / nourrissons avant le diagnostic: odds ratio [OR], [% intervalle de confiance {CI}, -], P =; jours d’oxygénation CPAP, sur la base de l’exigence d’un jour dans les cas: OR, [% CI, -], P = Dans une analyse multivariée incluant toutes les variables cliniques, les OTU ont été ajoutées, l’interaction avec les facteurs cliniques Le modèle résultant était composé de termes, dont le premier était significatif. Le premier terme significatif était le nombre de lectures de Clostridium OTU, avec un OR ajusté de% CI, – ; P = Le deuxième terme significatif était une interaction entre le nombre de lectures de Klebsiella OTU et le nombre de jours où le nourrisson nécessitait de l’oxygène CPAP avant le diagnostic Basé sur le nombre moyen de lectures trouvées au stade Bell / nourrissons NEC et sur un jour oxygène, OR ajusté était% CI, -; P = La relation du terme interactif est explorée dans Figure Le facteur de risque associé aux lectures de Clostridium OTU est montré indépendant des jours nécessitant de l’oxygène CPAP, reflété dans le modèle en restant un terme individuel Les cas ont donc été définis en fonction du terme contribué le plus fortement pour indiquer NEC, résultant en cas de NEC «Clostridium-associated» et de NEC «Klebsiella OTU-associated» Dans ces cas, les échantillons les plus proches du diagnostic avaient une plus grande abondance de Klebsiella. ces cas signifient = P & lt; Cette dichotomie est visible sur la Figure où les groupes de cas présentent des cycles temporels très différents. Le cas final N ne satisfaisait à aucun critère Nous n’avons trouvé aucune évidence de syndromes NEC différents dans notre cohorte de patients «associés à Clostridium» et «Klebsiella OTU»

Figure Vue largeDownload slideRelationship between Klebsiella unité taxonomique opérationnelle lectures de l’OTU et jours de pression positive continue des voies respiratoires CPAP besoin en oxygène par quartiles Les cercles noirs indiquent «entérocolite nécrosante associée à Clostridium» NEC; les X noirs indiquent les cercles blancs NEC Control «Klebsiella OTU associés» et les NEC «Clostridium associés» sont répartis uniformément sur les quartiles. En revanche, les échantillons NEC «Klebsiella OTU associés» se regroupent au-dessus du troisième quartile. lectures de l’unité OTU et jours de pression positive continue des voies respiratoires Besoin d’oxygène CPAP par quartiles Les cercles noirs indiquent une entérocolite nécrosante «associée au Clostridium» NEC; les X noirs indiquent les cercles blancs NEC Control «Klebsiella OTU associés» et les NEC «Clostridium associés» sont répartis uniformément sur les quartiles. Par contre, les échantillons NEC «Klebsiella OTU associés» se situent au-dessus du troisième quartile

Figure View largeTélécharger la lameÉvolution du microbiote fécal chez les nourrissons atteints d’entérocolite nécrosante NEC Stade de la cloche / Le jour du diagnostic NEC est indiqué en bas à droite de chaque histogramme Les cas définis comme NEC sont «N, N, N et N» Les cas définis comme NEC « Klebsiella OTU » sont N, N, N, N, N, N, et NN ne rentre dans aucun des deux groupes Abréviation: OTU, unité taxonomique opérationnelleFigure View largeTélécharger diapositiveEvolution du microbiote fécal chez les nourrissons atteints d’entérocolite nécrosante Stade NEC Bell / Le jour du diagnostic NEC est indiqué en bas à droite de chaque histogramme Les cas définis comme NEC «Clostridium-associated» sont N, N, N et N Les cas définis comme NEC «Klebsiella OTU-associated» sont N, N, N, N, N, N et NN ne rentre dans aucun des deux groupes Abréviation: OTU, unité taxonomique opérationnelle

Critères de sélection NEC

En utilisant les facteurs significatifs ci-dessus, un score de risque pour chacune des dichotomies NEC a été calculé pour tous les échantillons des contrôles et les échantillons avant le diagnostic pour les cas Les seuils calculés ont permis une classification correcte des cas et de la sensibilité des nourrissons témoins. les deux cas sont survenus au cours de la première semaine de vie. Les cas d’ECN «associés à Clostridium» ont été évalués comme étant à risque d’écart-type moyen de jours, de jours avant le diagnostic et de cas de NEC associés à Klebsiella. DS, jours avant le diagnostic Ces périodes à haut risque présymptomatiques sont reflétées dans les données brutes de l’UTO; l’OTU de Clostridium a augmenté significativement la semaine précédant le diagnostic P = dans les échantillons, tandis que l’OTU de Klebsiella est restée à des niveaux élevés dans les semaines précédant le diagnostic. Ces critères de dépistage ont ensuite été testés sur les nourrissons du stade Bell. les bébés ont continué à développer NEC confirmé Deux des bébés de Bell stade ont été classés comme des cas, et le contrôle infantile a été mal classé

Identification des espèces de Clostridium

Dans tous les échantillons où l’OTU de Clostridium était présent comme au moins% de lectures de séquençage, C perfringens a été isolé par culture Bien que tous les isolats de C perfringens étaient de type A, ils différaient tous les uns des autres par typage fAFLP Trois des isolats de nourrissons avec NEC étaient en outre trouvé pour contenir le gène de la toxine bêta Cela n’a été trouvé dans aucun des isolats du nourrisson de contrôle Tableau supplémentaire

Identification des membres de Klebsiella OTU

Bien que le pyroséquençage ait indiqué une UTO prédominante de Klebsiella, qui était souvent la seule OTU des Enterobacteriaceae, aucune espèce prédominante isolée en culture n’a été identifiée: Klebsiella pneumoniae, K oxytoca, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli et Serratia marcescens ont toutes été identifiées. était pas de différence systématique entre les échantillons de cas et les contrôles

DISCUSSION

Des études antérieures ont mis l’accent sur l’identification de pathogènes causaux uniques dans NEC, mais aucune n’a été systématiquement trouvée. Nous avons démontré la présence de groupes distincts de nourrissons NEC basés sur les organismes prédominants dans le microbiote avant le diagnostic: C perfringens ou Klebsiella OTU of Enterobacteriaceae La signature microbienne était la seule caractéristique discriminante; ces syndromes cliniques n’étaient pas distincts Malgré le regroupement bien documenté des cas de NEC – et il y a des cas temporellement associés dans notre propre cohorte, par exemple des mois, – et – notre étude réfute la proposition selon laquelle l’un de ces cas représentait des éclosions Il existe un mélange de NEC «associé à Clostridium» et «NEC associé à Klebsiella OTU» dans chaque groupe de cas temporellement associé, et chaque souche de C perfringens est considérée comme un pathogène étiologique putatif puisque NEC a été décrit pour la première fois chez l’animal. modèles de NEC, C perfringens isolés à partir de prélèvements fécaux de nourrissons prématurés avec NEC causent des lésions cæcales Dans une étude clinique, les bébés avec NEC et C perfringens dans leurs selles avaient un début précoce, une évolution clinique plus sévère, une plus grande gangrène, et taux de mortalité plus élevé La présence de souches portant le gène de la toxine bêta codée par un plasmide dans les cas de NEC «associés à Clostridium», mais aucune La toxine a été caractérisée à l’origine dans un isolat de C perfringens provenant d’un porcelet atteint d’entérite nécrotique , et s’est avérée être cytotoxique pour les cellules CaCo-epitheliales colorectales humaines . sont nécessaires pour déterminer si le gène de la toxine bêta est exprimé et contribue aux résultats NECOur des enfants NEC «Klebsiella OTU-associés» sont en accord avec des études récentes de microbiote NEC qui ont constaté une augmentation de la proportion d’Enterobacteriaceae et d’autres Protéobactéries Torrazza et al rapportent une forte association entre un OTU de Klebsiella et un risque de NEC Des échantillons contenant une OTU de même type dans notre étude, nous avons isolé plusieurs espèces différentes d’Enterobacteriaceae, mais nous n’avons pas pu associer NEC. avec une espèce individuelle Ceci souligne la nécessité d’aller au-delà de la caractérisation de l’ARNr S, en Famille des Enterobacteriaceae, où le gène est relativement bien conservé On considère que des niveaux élevés persistants d’entérobactéries anaérobies facultatives dans les échantillons fécaux représentent un retard de maturation du microbiote GI, ainsi qu’un taux réduit d’anaérobies tels que Bifidobacterium et Bacteroides Normalement, avec le temps, le microenvironnement GI devient appauvri en oxygène, conduisant à une prédominance d’organismes anaérobies Nous supposons qu’un besoin prolongé de jours d’oxygénation CPAP chez nos nourrissons NEC « Klebsiella OTU » peut avoir affecté l’aérobie de la lumière intestinale. Cette étude a porté sur la caractérisation du microbiote fécal associé à NEC et ne traite pas du mécanisme de la maladie. À la lumière de nos résultats, de futurs travaux in vitro sur la production de toxines des isolats de C perfringens et les facteurs de virulence potentiels. chez les Enterobacteriaceae, les organismes peuvent contribuer à la compréhension Une limite importante de l’étude est que les bébés qui développent NEC dans la première semaine de la vie sont systématiquement moins susceptibles d’avoir fourni des échantillons séquentiels pour l’analyse, et étaient donc sous-représentés. Nous pourrions, cependant, supposer que NEC se développe chez ces nourrissons. moins directement la conséquence du microbiote GI, reflétant plutôt une autre complication de la vie extra-utérine précoce. A noter, le cas N, qui ne rentrait pas dans les groupes NEC « Clostridium associé » ou « Klebsiella OTU », développé NEC le jour. Les signatures microbiennes identifiées dans cette étude constituent des biomarqueurs potentiels sur lesquels fonder la surveillance PCR quantitative des échantillons fécaux pour identifier les nourrissons à haut risque de NEC, tout en distinguant les NEC «associés à Clostridium» et les NEC «associés à Klebsiella OTU». peut permettre un traitement précoce et spécifique

Données supplémentaires

Les documents supplémentaires sont disponibles à Clinical Infectious Diseases en ligne http: // cidoxfordjournalsorg Les documents supplémentaires sont constitués de données fournies par l’auteur qui sont publiées au profit du lecteur Les documents affichés ne sont pas copiés Le contenu de toutes les données supplémentaires sont de la seule responsabilité des auteurs ou les messages concernant les erreurs doivent être adressés à l’auteur

Remarques

Remerciements Nous remercions le Dr Peter C M Chow, le Dr Lidia Tyszczuk et nos collègues de l’unité de soins néonataux intensifs du NHS Trust du service de santé national de l’Imperial College pour avoir soutenu l’étude; Le Dr Elizabeth Powell, le Dr Frances Bolt et le Professeur Neil Fairweather pour une discussion utile; Dr Corinne Amar et Dr Craig Swift, Public Health England, Services de référence pour les agents pathogènes d’origine alimentaire, Colindale pour l’analyse de typage de C perfringens; et Dr Tim Planche et Helen Liddy Département de microbiologie médicale, St George’s Hospital pour l’utilisation de la désorption laser assistée par matrice / temps d’ionisation des installations de vol Nous remercions les participants et leurs familles pour leur contribution à cette étudeDisclaimer Cet article présente la recherche indépendante financée par le National Institute for Health Research NIHR Les opinions exprimées sont celles des auteurs et pas nécessairement celles du NHS, du NIHR, du ministère de la Santé ou d’autres bailleurs de fonds. Soutien financier Ce travail a été financé par la Fondation Winnicott; Méningite maintenant; le Wellcome Trust; l’Asmarley Trust; et le Centre de recherche biomédicale du NIHR basé à Imperial Healthcare NHS Trust et Imperial College London KS est financé par une Bourse de recherche au doctorat du NIHR NIHR-DRF — Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: Aucun conflit signaléTous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation de Conflits d’intérêts potentiels Les conflits que les éditeurs jugent pertinents pour le contenu du manuscrit ont été divulgués