Diagnostic de l’infection neuroinvasive à l’astrovirus chez un adulte immunodéprimé avec encéphalite par un séquençage de nouvelle génération non biaisé

Le séquençage de séquençage de la nouvelle génération Metagenomic a été utilisé pour diagnostiquer un cas inhabituel et fatal d’encéphalite progressive chez un adulte immunodéprimé présentant une surdité bilatérale au début de la maladie. Les études de séquençage et de confirmation ont révélé une infection neuro-invasive du cerveau par un astrovirus appartenant à une VA récemment découverte. / HMO clade

Clade VA / HMO astrovirus, encéphalite, surdité, séquençage de prochaine génération, découverte de pathogènesVoir l’article majeur par Brown et al sur les pages -, et le commentaire éditorial de Calistri et Palù sur les pages – L’étiologie de l’encéphalite aiguë reste non diagnostiquée dans environ Le diagnostic opportun est entravé par le manque de tests disponibles pour évaluer rapidement l’étendue des agents communs, rares ou inconnus responsables de l’encéphalite. Le séquençage de nouvelle génération métagénomique non séquencé NGS offre la possibilité d’identifier les pathogènes sans connaissance a priori de la cible [ ] Nous avons récemment développé une identification de pathogène ultra-rapide basée sur une séquence bioinformatique compatible avec le nuage [SURPI] pour détecter tout pathogène dans la base de données de référence GenBank Les tests NGS et l’analyse SURPI ont déjà été utilisés pour diagnostiquer la neuroleptospirose chez un enfant fulminant l’encéphalite qui avait échappé à tous les tests conventionnels, ce qui a entraîné une thérapie ecovery Ici nous avons utilisé NGS pour rechercher une étiologie infectieuse dans un cas inhabituel d’encéphalite progressive se présentant comme une surdité bilatérale

RAPPORT DE CAS

Un homme âgé de 1 an atteint de leucémie lymphocytaire chronique a subi une greffe allogénique de moelle osseuse en septembre. La greffe était dépourvue d’un seul allèle antigénique leucocytaire humain DQB et avait été appauvrie en lymphocytes T en utilisant l’alemtuzumab in vivo. Il a été greffé le lendemain de la greffe. diarrhée de l’infection norovirus, son cours post-transplantation était banal jusqu’à la mi-Octobre, quand il a développé l’acouphène et la surdité neurosensorielle rapidement progressive, entraînant une perte auditive subtotale bilatérale & gt; dB sur – semaines Imagerie par résonance magnétique cérébrale L ‘IRM était sans particularité, tout comme le liquide céphalo – rachidien LCF analyse leucocytes / μL avec% neutrophiles et% lymphocytes, globules rouges / μL, glucose mmol / L [gamme normale, – mmol / L], protéine mg / dL [plage normale, – mg / L], absence de bandes oligoclonales Réaction en chaîne par polymérase virale Le test PCR du LCR était négatif pour les infections à entérovirus et herpèsvirus Le patient a été traité empiriquement avec du valacyclovir à forte dose, des antibiotiques à large spectre et g / En dépit de ces interventions, il a développé de nouveaux symptômes de dyspnée centrale, d’hypotension orthostatique, de nausée et d’aggravation graduelle de l’équilibre. Répétition neurologique confirmée dysfonction vestibulo-chro-clastique persistante semaines après l’apparition des symptômesPar la mi-décembre, le patient devenait de plus en plus irritable. intermittent agité Il restait des lymphocytes lymphopéniques × / μL [gamme normale, – × / μL] Les IRM du cerveau étaient unremar kable, tout comme le test sérique pour les anticorps antineuronaux; un électroencéphalogramme a révélé une encéphalopathie diffuse. Étant donné la suspicion persistante d’une étiologie virale, le patient a été traité avec des glucocorticoïdes à forte dose et de nouveau avec des IgIV. Il a commencé à refuser des liquides, de la nourriture et des médicaments. Figure A Vers la fin du mois de décembre, une biopsie du lobe frontal a été réalisée Histologie révélant une gliose réactive et une infiltration diffuse par des lymphocytes CD / lymphocytes Figure B Développement microbiologique extensif le test du tissu de biopsie pour une étiologie infectieuse était négatif Tableau supplémentaire

dosage de séquençage de nouvelle génération de métagénomique pour le diagnostic de maladie infectieuse En utilisant le pipeline SURPI d’identification de pathogène ultra-rapide basé sur la séquence , & gt; millions de lectures générées à partir de l’échantillon de biopsie du cerveau du patient ont été analysées en quelques heures pour les pathogènes potentiels D, la récupération du génome et l’analyse comparative par paires d’astrovirus humain HAstV VA / HMO-C-UK Mapping of Astroviridae de la courbe de couverture du génome bp de la paire de base; montré en correspondance avec le génome de HAstV-VA / HMO-C-UK, avec confirmation de séquence en utilisant une réaction en chaîne par polymérase PCR lignes bleues Les tracés d’identité par paire ont révélé une identité de nucléotides% &% partagée entre la souche Astov de l’astrovirus HAstV-VA / HMO-C -UK et autres virus VA- / HMO-C E, Hybridation in situ de tissu cérébral du patient atteint L’hybridation d’acide nucléique utilisant des sondes au gène de capside AstV rouge et le contrôle GADPH bleu révèle un marquage sélectif de neurones infectés jaunes, des noyaux colorés avec DAPI La proportion estimée de cellules colorées positives pour l’AstV était d’environ% F, arbre phylogénétique des virus AstVs VA- / HMO-C des mammifères encéphalitiques humains dans le clade VA / HMO associé à l’encéphalite chez les humains HAstV-VA / HMO-C-UK et HAstV-SG sont plus étroitement liés aux AstV encéphalitiques chez les autres mammifères MAstV et BAstV qu’aux HAstV classiques – ou AstV chez le clade MLB Les AstV mammifères liés à l’encéphalite sont surlignés en rouge. Abréviations: BAStV, l’astrovirus bovin; DAPI, ‘, -diamidino-phénylindole; GAPDH, glycéraldéhyde – phosphate déshydrogénase; HMOAst-C, astrovirus HMO-C; MAstV, astrovirus du vison; ORF, cadre de lecture ouvert; RdRp, ARN polymérase ARN-dépendante; SURPI, identification de pathogène ultra-rapide basée sur des séquencesFigure View largeTélécharger slideA, Imagerie par résonance magnétique du cerveau Les vues coronales gauche et axiale droite montrent des anomalies pondérées en T dans les flèches blanches thalamus et mésencéphale B, Études histologiques et immunohistochimiques du tissu de biopsie cérébrale Un cerveau une biopsie du lobe frontal droit a montré une gliose réactive frappante diffuse dans le neuroparenchyme mis en évidence par immunocoloration pour la protéine acide fibrillaire glibale Diffusion diffuse de petits nombres de lymphocytes T réactifs immunopositifs pour CD, des flèches noires sont observées Immunocoloration pour CD, un marqueur microglial, a révélé microgliale marquée activation dans le cortex et la substance blanche Les processus cellulaires microgliaux ont souvent été observés en contact étroit avec les neurones, flèches noires Aucune inclusion virale n’a été observée C, Un séquençage métagénomique de nouvelle génération pour le diagnostic des maladies infectieuses pipeline , & gt; millions de lectures générées à partir de l’échantillon de biopsie du cerveau du patient ont été analysées en quelques heures pour les pathogènes potentiels D, la récupération du génome et l’analyse comparative par paires d’astrovirus humain HAstV VA / HMO-C-UK Mapping of Astroviridae de la courbe de couverture du génome bp de la paire de base; montré en correspondance avec le génome de HAstV-VA / HMO-C-UK, avec confirmation de séquence en utilisant une réaction en chaîne par polymérase PCR lignes bleues Les tracés d’identité par paire ont révélé une identité de nucléotides% &% partagée entre la souche Astov de l’astrovirus HAstV-VA / HMO-C -UK et autres virus VA- / HMO-C E, Hybridation in situ de tissu cérébral du patient atteint L’hybridation d’acide nucléique utilisant des sondes au gène de capside AstV rouge et le contrôle GADPH bleu révèle un marquage sélectif de neurones infectés jaunes, des noyaux colorés avec DAPI La proportion estimée de cellules colorées positives pour l’AstV était d’environ% F, arbre phylogénétique des virus AstVs VA- / HMO-C des mammifères encéphalitiques humains dans le clade VA / HMO associé à l’encéphalite chez les humains HAstV-VA / HMO-C-UK et HAstV-SG sont plus étroitement liés aux AstV encéphalitiques chez les autres mammifères MAstV et BAstV qu’aux HAstV classiques – ou AstV chez le clade MLB Les AstV mammifères liés à l’encéphalite sont surlignés en rouge. Abréviations: BAStV, l’astrovirus bovin; DAPI, ‘, -diamidino-phénylindole; GAPDH, glycéraldéhyde – phosphate déshydrogénase; HMOAst-C, astrovirus HMO-C; MAstV, astrovirus du vison; ORF, cadre de lecture ouvert; RdRp, ARN polymérase ARN-dépendante; SURPI, identification de pathogène ultra-rapide par séquenceL’absence de diagnostic et la détérioration neurologique progressive du patient, le LCR et le tissu de biopsie cérébrale ont été analysés en janvier par séquençage métagénomique de nouvelle génération NGS NGS analyse de la biopsie cérébrale, assemblage du génome, Malgré l’absence de traitements approuvés, le patient a été traité avec de la ribavirine et de l’IVIG. Cependant, il n’a pas répondu à ces interventions et est resté dans un état de conscience minimale après le retrait de la sédation en mars. est décédé à la fin du mois de mai, des mois après le diagnostic de l’END et environ quelques mois après l’apparition des symptômes

Méthodes

Cette étude a été approuvée par les commissions d’évaluation institutionnelle de l’Université de Californie, San Francisco et University College London Méthodes d’extraction des acides nucléiques, séquençage NGS, analyse bioinformatique, PCR confirmatoire et l’hybridation in situ figurent dans l’annexe supplémentaire

RÉSULTATS

Au total, et les lectures ont été obtenues en utilisant NGS du tissu de biopsie et CSF, respectivement, avec des temps d’exécution et des heures d’échantillonnage, et les temps d’analyse SURPI correspondants des heures et des heures. ont été identifiés comme AstV, sans lectures crédibles correspondant à d’autres agents pathogènes viraux ou non viraux. La cartographie de tous les astrovirus se lit sur le génome de l’astrovirus VA HAstV-VA ou l’astrovirus HMO-C HMOAst-C presque identique Figure D et Figure supplémentaire Dans l’échantillon CSF, les lectures d’AstV étaient absentes, avec seulement la détection des séquences d’Anellovirus et de phage correspondant à la flore virale non pathogène Tableaux supplémentaires et La confirmation des séquences d’AstV dans le tissu cérébral a été confirmée par RT-PCR. L’échantillon A et BA CSF prélevé en peropératoire au moment de la biopsie cérébrale était également faiblement positif par le seuil du cycle RT-PCR = Figure supplémentaire , mais les échantillons de LCR prélevés et les jours précédant la procédure étaient négatifs. La RT-PCR et le séquençage de Sanger ont également été utilisés pour combler les lacunes et récupérer le génome complet du virus, provisoirement appelé «astrovirus humain VA- / HMO-C». , souche UK « HAstV-VA / HMO-C-UKHAstV-VA / HMO-C-UK s’est avéré partager% identité nucléotidique à HAstV-VA / HMO-C, associée à une diarrhée aiguë chez les enfants ; % d’identité avec HAstV-SG, détecté dans le tissu cérébral d’un garçon avec une agammaglobulinémie liée à l’X et une encéphalite mortelle ; Figure D Le diagnostic de l’infection cérébrale neurovasculaire AstV a été confirmé par l’hybridation in situ du tissu cérébral à l’aide de sondes dérivées du système nerveux central. La capside HAstV-VA / HMO-C-UK, démontrant la localisation virale aux neurones Figure E L’analyse phylogénétique a placé l’AstV dans un clade VA / HMO qui inclut les AstVs VA et HMO-C décrits précédemment , et qui se sépare du classique HAstVs – Figure F

DISCUSSION

Les AstV sont des causes fréquentes de gastro-entérite virale chez l’homme, mais ont récemment été décrits comme des agents étiologiques potentiels de l’encéphalite Chez l’homme, des études ont déjà détecté l’AstV dans les tissus cérébraux d’enfants atteints d’encéphalite mortelle. garçon immunodéprimé avec une agammaglobulinémie liée à l’X et infecté par HAstV-SG, un membre du clade VA / HMO Figure F Il est intéressant de noter que le garçon vivait à proximité d’une ferme de visons, suggérant un lien zoonotique potentiel entre HAstV L’infection par le GS et un astrovirus apparenté du vison Le second cas était un nourrisson de huit mois présentant une immunodéficience combinée sévère qui développait une maladie multiorganique disséminée à HAstV, avec détection virale dans le tissu cérébral par RT-PCR Similaire aux autres cas, notre patient , le premier cas documenté d’infection à l’astrovirus chez un adulte, a été sévèrement immunodéprimé en raison de sa greffe de moelle osseuse et d’une chimiothérapie antérieure. Études sérologiques de l’astrovirus VA- / HMO-C l’infection révèle des taux de prévalence élevés dans la population humaine, avec une séropositivité en% des enfants selon l’âge et jusqu’à 100% chez les adultes Il est donc frappant que les cas humains d’encéphalite astrovirus soient rares Nous postulons que l’infection par les astrovirus poliomyélite, asymptomatique ou associée à une diarrhée aiguë auto-résolutive chez la plupart des individus, avec une maladie sévère rarement observée. L’histologie légèrement anormale de notre patiente, avec des infiltrats inflammatoires mineurs de lymphocytes T dans la microglie Figure A, et l’absence de bandes oligoclonales du LCR suggèrent que Il a été incapable de monter une réponse inflammatoire efficace contre ce virus Ainsi son évolution clinique d’une encéphalite chronique progressive due à une infection par un astrovirus peut refléter son état fortement immunodéprimé. Les faibles taux d’astrovirus retrouvés dans le LCR indiquent une production inefficace de virions libres. d’une infection largement limitée au parenchyme cérébralNous croyons que l’astrov de notre patient L’infection à l’irus est survenue par voie fécale-orale, ce qui est typique pour les virus entériques. Cependant, bien que ce mécanisme de transmission soit compatible avec sa diarrhée associée au norovirus après l’infection, l’excrétion chronique de HAstV-VA / HMO-C-UK dans les selles n’était pas Tableau supplémentaire observé Contrairement au cas rapporté d’encéphalite VA- / HMO-C de l’astrovirus chez un enfant à proximité d’une ferme de visons , notre patient n’a signalé aucune exposition ou voyage inhabituel, ce qui fait craindre que son infection ait pu être Le traitement des patients atteints d’encéphalite à astrovirus présumée est difficile compte tenu de la rareté des cas et de l’absence d’un traitement efficace connu. Il a déjà été démontré que des IgIV à forte dose jouent un rôle dans le traitement de la gastro-entérite sévère des astrovirus. dose IVIG et glucocorticoïdes peuvent avoir stabilisé temporairement l’état de notre patient, le traitement n’a pas arrêté la progression de l’infection L’antibiothérapie n’est pas systématique dans les cas d’encéphalite, et les tests de RT-PCR conventionnels ne détectent que les types d’astrovirus classiques – et ne ciblent pas les membres du clade VA / HMO. L’étude souligne la faisabilité du déploiement de la métagénomique NGS en tant que test de diagnostic clinique ciblant simultanément tous les pathogènes potentiels La NGS devenant une technologie de plus en plus accessible, nous envisageons son application systématique pour le diagnostic «pan-microbien» des maladies infectieuses dans un avenir proche

Données supplémentaires

Les documents supplémentaires sont disponibles à Clinical Infectious Diseases en ligne http: // cidoxfordjournalsorg Les documents supplémentaires sont constitués de données fournies par l’auteur qui sont publiées au profit du lecteur Les documents affichés ne sont pas copiés Le contenu de toutes les données supplémentaires sont de la seule responsabilité des auteurs ou les messages concernant les erreurs doivent être adressés à l’auteur

Remarques

Remerciements Nous remercions le personnel de l’Université de Californie, San Francisco Genomics Core Facility pour le séquençage; le centre d’histologie et de microscopie optique Gladstone pour l’utilisation de leur microscope à fluorescence; Shekar Menon chez Affymetrix pour des conseils sur l’optimisation de l’hybridation in situ QuantiGene; et Deanna Lee, Sneha Somasekar et Nancy Joseph pour des discussions sur les méthodes optimales d’extraction tissulaire. Les contributions KSP, FMM, RP, VG et MPL ont participé aux soins du patient SNN, VG et CYC ont conçu et conçu les expériences SNN, ES, JAG , et PG ont effectué les expériences SNN, SF et CYC ont analysé les données CYC et SM ont contribué les réactifs / matériaux / outils d’analyse SNN, KSP, JAG, MPL, SM, VG et CYC ont écrit l’article Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final CYC avait un accès complet à toutes les données de l’étude et avait la responsabilité finale de la décision de soumettre à la publicationDisclaimer Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la collecte de données, l’analyse, le recrutement des patients ou la décision de publier. des Instituts nationaux de la santé R-HL, un Prix de la découverte de l’Université de Californie, et un prix Abbott Viral Discovery décerné à CYC Work à University College London par KSP, FMM, RP, JAG, PG, MPL, et VG ont reçu un soutien partiel de l’Institut national de recherche en santé Centre de recherche biomédicale et Centre de médecine expérimentale du cancer Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: Aucun conflit signaléTous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits d’intérêts potentiels Les conflits que les éditeurs jugent pertinents pour le contenu du manuscrit ont été divulgués