Découverte de Narlaprevir (SCH 900518): Un inhibiteur puissant de la sérine protéase du VHC NS3 de deuxième génération

L’infection par le virus de l’hépatite C (VHC) est une crise de santé mondiale entraînant une cirrhose du foie, un carcinome hépatocellulaire et une insuffisance hépatique chez l’humain. La population humaine dans le monde entier est chroniquement infectée par le VHC.2 Actuellement, les seuls schémas thérapeutiques disponibles sont l’interféron sous-cutané ou l’interféron pégylé à action prolongée, seul ou en association avec l’antiviral oral ribavirine3. Le traitement approuvé est encore loin. idéal pour les patients de génotype 1 difficiles à traiter4 et s’accompagne souvent d’effets indésirables. Il existe un besoin médical non satisfait de découvrir de nouveaux régimes plus efficaces et tolérables pour le traitement de l’infection par le VHC.Les avancées dans la compréhension des voies moléculaires de la réplication du VHC ont entraîné l’entrée de plusieurs antiviraux à action directe dans les dernières années. Depuis l’identification de ce virus, la sérine protéase NS3 contenue dans la région N-terminale de la protéine NS3 Cette sérine protéase semblable à la chymotrypsine joue un rôle central dans la réplication virale et, par conséquent, constitue une cible intéressante pour les agents antiviraux contre le VHC.6,7 Au cours de la dernière décennie, des efforts intenses ont été déployés pour découvrir de nouveaux agents moléculaires inhibent la sérine protéase NS3.8 Des études de preuve de concept chez l’homme avec BILN 2061, un inhibiteur macrocyclique P3 non covalent, ont validé cette hypothèse.9 Depuis lors, plusieurs inhibiteurs de la protéase NS3 ont progressé vers des essais cliniques chez l’homme. Actuellement, les plus avancés parmi ceux-ci sont le bocéprévir (SCH 503034), le 1,10,11 et le télaprévir (VX950), 12,13 de la classe réversible à liaison lente &#x003b1-cétoamide, dans l’évaluation humaine de phase III. Les inhibiteurs des études de phase II, appartenant à la classe macrocyclique non covalente structurellement distincte, comprennent les ITMN-191,14 TMC-435350,15 et MK-7009 (P2 ∢ macrocycle P4) .16 Autres inhibiteurs de la protéase NS3 en cours d’évaluation clinique BI-201335, ABT-450, PHX-1766, ACH-1625 et VX-813.8. L’inhibiteur 1 présentait Ki * = 14 nM dans le test de liaison à l’enzyme, 17 EC90 = 350 nM dans le test de réplicon à base de cellules, 18 et le profil pharmacocinétique acceptable chez les rats et les chiens (Figure ​ (Figure1) .1). Dans nos efforts pour découvrir un inhibiteur de la protéase du VHC de deuxième génération, nous nous sommes concentrés principalement sur l’amélioration de la puissance in vitro et du profil pharmacocinétique préclinique de l’inhibiteur, en particulier l’exposition chez le singe. De plus, pour atténuer d’éventuels problèmes de synthèse / purification qui pourraient survenir au cours du développement, il était nécessaire d’identifier une molécule qui existait comme un isomère unique, contrairement à 1, qui était un mélange de diastéréoisomères à P1. Fragment P4. Basé sur la structure cristalline aux rayons X de 1 liée à la protéase NS3, l’exploration de la zone P4 semblait intéressante, car une interaction supplémentaire avec l’enzyme pourrait potentiellement améliorer la puissance. Précédemment, nous avons exploré l’introduction de carbamate, céto, ester, imide ou fragments de P4 coiffés de sulfonamide sur le noyau de 1,8,19 & 22; alors que nous étions en mesure d’améliorer la puissance du réplicon et les propriétés pharmacocinétiques du rat dans la plupart des cas, être un défi. Cependant, une fraction cyclohexyle à P4 avec un groupe tert-butylsulfone en annexe a donné des résultats encourageants (figure ​ (figure 1) .1). Ainsi, l’inhibiteur 3 présentait une puissance de réplicon améliorée (EC90 = 100 nM) et présentait une bonne exposition au plasma de singe (AUC = 3,2 μ M · h, 3 mpk, po). Les études de recherche et de sauvetage en vue de la découverte d’un capuchon P4 contenant de la sulfone sont communiquées séparément. L’amélioration de la puissance et de l’exposition des singes dans cette série s’est accompagnée d’une perte disproportionnée de PK chez le rat. Ici, nous décrivons nos efforts dans la série P4 sulfone plafonné qui a abouti à la découverte de 37 (narlaprevir, SCH 900518), notre deuxième génération inhibiteur de sérine protéase NS3 du VHC actuellement dans les études de phase II.Synthèse du fragment cyclohexyle P4 coiffé de sulfone et plus L’alkylation de l’ester 4 avec le chlorure de benzyloxyméthyle a été effectuée. L’élimination du groupe protecteur et l’activation subséquente de l’alcool ont donné du mesylate 6. Le déplacement du groupe mésylate avec du tert-butylthiolate de sodium a donné du thioéther 7. L’hydrolyse de la partie ester, suivie de l’oxydation du thioéther, a fourni 8. Le réarrangement de Curtius de l’acide 8 a donné l’isocyanate 9, qui a réagi avec les intermédiaires précédemment décrits de type 10,11, suivie de l’oxydation de Martin pour fournir des composés cibles. de type 11 en mélange de diastéréoisomères P1. En variante, on a fait réagir l’isocyanate 9 avec l’ester P2 de P3 & spplus précédemment décrit 12.11 Hydrolyse de l’ester résultant en acide 13, et couplage subséquent avec P1 − P ′ intermédiaire de type 14, suivi par Dess − l’oxydation de Martin a fourni les composés cibles. Une séparation par CLHP du mélange a donné le diastéréoisomère (S) -P1 requis de type 15.Synthèse de P1 − P ′ Le fragment est montré dans le schéma 2. Ainsi, une réduction de la L-norleucine 16 suivie d’une protection amino fournit 17. Des conditions d’oxydation modérées employant l’agent de blanchiment / TEMPO conduisent à l’aldéhyde 18. La réaction de Passerini de 18 avec le cyclopropylisonitrile 19 fournit l’intermédiaire protégé 20. Déprotection séquentielle démêlée le nécessaire P1 − P ′ intermédiaire 21 à environ 60% de rendement global.Scheme 2Nos efforts pour une synthèse améliorée des composés cibles, en particulier 37, sont présentés dans le schéma 3.Alors que la séquence synthétique (Schéma 1) décrite précédemment était utile pour les études SAR, nous avons été mis au défi de développer une meilleure voie qui était susceptible d’être mise à l’échelle. Une alkylation médiée par l’acide de Lewis de 4 avec le thioéther 30 fournit 7 en une étape. L’hydrolyse de l’ester méthylique en acide 31, suivie d’une oxydation à l’oxone, a donné la sulfone 8 en un rendement de 62% (3 étapes). Le traitement de l’isocyanate 9 décrit ci-dessus, avec de la L-tert-leucine 32, dans un milieu biphasique a donné 33 qui ont cristallisé dans l’acétate d’éthyle. L’acide 33 a été couplé avec de l’ester méthylique de diméthylcyclopropylproline 34, ce qui a donné l’ester méthylique de P4 et P2. L’hydrolyse de 35 a donné l’acide P2 de P4 complètement assemblé, après cristallisation, avec un rendement de 86%. Les deux intermédiaires avancés, P4 − P2 acide 13 et P1 − P ′ le chlorhydrate d’amine 21, ont été couplés en utilisant essentiellement les conditions décrites ci-dessus. Après une brève étude, nous avons identifié les conditions appropriées pour l’oxydation finale. Ainsi, l’intermédiaire 36 a été oxydé en utilisant un agent de blanchiment / TEMPO dans des conditions tamponnées. Le produit obtenu après traitement a été cristallisé à partir d’un mélange d’eau et d’acétone pour donner 37 avec un rendement élevé. Il convient de mentionner que toute la séquence de synthèse de 37 a été réalisée sans purification de gel de silice, tout en conservant l’intégrité stéréochimique au centre P1. Les composés cibles du Schéma 3 synthétisés dans ces études ont été testés pour l’inhibition de la sérine protéase NS3 du VHC en utilisant le dosage spectrophotométrique continu, 17 et l’inhibition de la réplication du VHC in vitro en utilisant le test de réplicon subgénomique18. Tous les composés ont été testés pour l’inhibition de l’élastase des neutrophiles humaines (HNE) comme mesure de la sélectivité. Comme décrit ci-dessus, l’inhibiteur 3, avec un fragment cyclohexyle coiffé de tert-butylsulfone à P4, présentait une puissance de réplicon et une exposition orale de singe améliorées par rapport à 1. Cependant, cette série d’inhibiteurs contenant P ′ le résidu d’amide primaire présentait un mauvais profil PK de rat. Au cours de nos études qui ont conduit à la découverte de 1, il a été observé que P ′ les amides secondaires, en particulier les allylamides, fournissent des inhibiteurs ayant un bon profil PK de rat. Afin d’améliorer l’exposition plasmatique des inhibiteurs coiffés au sulfone P4 chez le rat, nous avons ensuite entrepris d’introduire un résidu allylique au P ′ position. Nous savions également, d’après nos études précédentes, que la fraction P1 cyclobutylalanine, en général, n’était pas tolérée avec un résidu allylique (ou petit alkyle) à P ′ position. D’où l’introduction de P ′ l’amide allylique a été réalisée avec divers substituts P1 pour identifier P1 & P; # x02032; combinaison (tableau 1) .Tableau 1P1 SAR des inhibiteurs de type 11 Synthèse de P ′ l’inhibiteur contenant l’amide allylique correspondant à 3 a donné 38. Alors que 38 ont perdu la puissance du réplicon par rapport à 3, il y avait une amélioration mesurable de l’exposition orale chez le rat (AUC = 2,8 μ M · h). L’inhibiteur 39 contenant la fraction cyclopropyl alanine P1 présentait un bon pouvoir de réplicon (EC90 = 140 nM) et une bonne PK de rat et de singe (ASC = 1,7 et 7,1 μ M · h, respectivement). Les inhibiteurs 40 et 42 ont montré un profil similaire; bonne puissance et PK du rat, avec AUC de singe suboptimale et sélectivité. L’inhibiteur 41 contenant la fraction norleucine P1 a présenté un bon profil global, avec EC90 = 180 nM, une bonne sélectivité (HNE / HCV = 1350) et une exposition orale chez les rongeurs (ASC = 5.1 μ M · h) et les grands animaux ( ASC = 5,5 μ M · h). Sur la base de l’activité, de la sélectivité et du profil pharmacocinétique, y compris une biodisponibilité orale plus élevée chez le rat, nous avons décidé de poursuivre les études avec le fragment norleucine à la P1. Tout en explorant le résidu allylique comme P ′ substituant pour améliorer le profil pharmacocinétique des inhibiteurs chez le rat, nous étions conscients du fait qu’une double liaison terminale peut potentiellement être une responsabilité toxicologique. Afin d’évaluer cette responsabilité potentielle, un analogue (structure non représentée) contenant un résidu allylique à P ′ a été soumis à une étude in vivo chez le rat. Les résultats indiquent que des quantités mineures d’adduit d’hydroxy-glutathion (GSH) ont été formées. Cette observation a soulevé la possibilité de la formation in vivo d’un époxyde réactif à partir de l’oléfine terminale, ce qui serait hautement indésirable et aurait des problèmes toxicologiques. Ainsi, notre tâche suivante était de trouver un remplacement approprié pour le fragment allylique. En outre, les inhibiteurs décrits ci-dessus étaient tous des mélanges de diastéréoisomères à P1, similaires à 1. Une condition clé que nous avions définie était l’identification et le développement d’un inhibiteur approprié sous la forme d’un isomère unique. Nous avons donc mené d’autres études SAR sur le P ′ région en utilisant un fragment P1 de norleucine en tant qu’isomère unique (S-stéréochimie). Résultats du P ′ Les études SAR sont présentées dans le tableau 2.Tableau 2P ′ SAR des inhibiteurs de type 15 Dans nos efforts pour remplacer le fragment allylique, nous avons introduit un groupe méthyle à P ′ résultant en le composé 43, avec l’enzyme désirable (Ki * = 4 nM) et la puissance du réplicon (EC90 = 55 nM), et une très bonne sélectivité (HNE / HCV = 1500). Alors que l’ASC du rat était raisonnable (2,2 μ M · h) pour 43, l’ASC du singe était plutôt faible (0,4 μ M · h). Extension de la chaîne à P ′ La fraction éthyle a provoqué 44 une légère perte de puissance et de sélectivité, bien qu’une amélioration modérée de l’ASC du rat. Le n-propyle, 45, et l’analogue de cyclopropylméthyle, 46, présentaient une puissance similaire (EC90 = 100 nM). Introduction de la fraction cyclopropyle à P ′ l’inhibiteur 37, avec un profil global significativement amélioré. Ainsi, 37 ont montré une excellente puissance (EC90 = 40 nM), et une amélioration de 10 fois par rapport au composé 1. En outre, l’exposition des rats et des singes était également supérieure à 1, avec ASC = 6,5 et 1,1 μ M &#x000b7 h, respectivement. Augmenter le P ′ la taille du cycle en cyclobutyle (47) et le fragment cyclopentyle (48) ont entraîné une perte progressive de la puissance de l’enzyme. De même, la substitution du cycle cyclopropyle s’est révélée préjudiciable (49, Ki * = 300 nM). Alors que l’éther contenant du P0450 présentait un bon pouvoir de réplicon (EC90 = 80 nM), l’inhibiteur contenant la sulfone, 51, ne présentait aucune amélioration de puissance comparé à 1. Substitutions aromatiques et hétéroaromatiques à P ′ position (inhibiteurs 52 − 61) a montré une bonne activité du réplicon, sauf 53 et 57. L’inhibiteur contenant du thiazole 56 a présenté une activité excellente (Ki * = 2,7 nM, EC90 = 40 nM, ∼ sélectivité (HNE / HCV = 1200). Alors que l’exposition au singe pour 56 était significativement améliorée (AUC = 1,9 μ M · h), PK PK (ASC = 1,2 μ M · h) était similaire à celle de 1. Dérivés d’acides aminés P ′ les substituts (inhibiteurs 62 − 66) ont entraîné une perte de puissance, à l’exception de 66 (EC90 = 50 nM). Malheureusement, 66 ne présentaient aucune exposition plasmatique à des doses orales chez les rats. De ces explorations, il était clair que le fragment cyclopropyle était le meilleur P ′ résidu (37), fournissant un profil global supérieur comparé à 1. Les résultats du tableau 1 ont démontré que les variations de P1 pourraient avoir une influence bénéfique sur le profil d’activité de l’inhibiteur. Ayant identifié le P &#x02032 approprié; partie, nous avons ensuite étudié la zone P1 afin de trouver la combinaison la plus appropriée (tableau 3). L’inhibiteur 67, avec la norvaline P1, présentait une puissance et un profil PK similaires à 37. Malheureusement, la sélectivité (HNE / HCV) était médiocre. L’introduction du résidu P1 de la trifluoronorvaline, censée améliorer la sélectivité sur la base de nos études précédentes, a abouti à l’inhibiteur 68. Une amélioration mesurable de la sélectivité a été observée pour 68, bien qu’avec une exposition au rat inférieure à celle acceptable. Alors que l’inhibiteur P1 contenant de la cyclopropylalanine 69 était équipotent à 37, l’exposition et la sélectivité chez le rat n’étaient pas optimales. L’incorporation du résidu P1 de l’homocyclopropylalanine, censée augmenter la sélectivité, a entraîné l’inhibiteur 70 avec EC90 = 30 nM, une bonne sélectivité (HNE / HCV = 820) et une exposition des singes similaire à 37.Table 3, nos efforts ont permis d’identifier deux composés prometteurs , 70 et 37, avec des caractéristiques souhaitables. Alors que les deux inhibiteurs étaient essentiellement équipotents, 37 ont démontré un meilleur profil pharmacocinétique global. Lors de l’administration par voie orale chez le rat, 37 affichaient une très bonne ASC de 6,5 μ M · h et une biodisponibilité de 46%. 37 était bien réparti dans l’organe cible; La concentration hépatique du rat 8 heures après l’administration (C8h) était de 750 ng / g. Dans une étude in vivo similaire chez le rat, 70 présentaient une AUC et une biodisponibilité orale plus faibles (2,1 μ M · h et 21%), et le C8h du foie n’était que de 90 ng / g. L’exposition orale du chien était modérée pour 37 (AUC = 0,9 μ M · h, F = 29%). Les données correspondantes pour 70 étaient légèrement inférieures, ASC = 0,5 μ M · h et F = 16%. Plus important encore, chez les singes, l’inhibiteur 37 présentait une ASC de 1,1 μ M · h, avec une biodisponibilité orale de 46%, une amélioration significative par rapport à 1. Cette amélioration, bien qu’elle ne soit pas apparente selon les caractéristiques structurelles de 37 possiblement à travers un mécanisme de transport spécifique aux singes. Sur la base du profil pharmacocinétique susmentionné chez trois espèces, l’inhibiteur 37 a été considéré pour une évaluation ultérieure. Les études de résistance préclinique ont indiqué que 37 était résistante croisée aux mutations élevées contre 1, à la fois dans les tests enzymatiques et de réplicons. Cependant, 37 ont conservé plus d’activité contre de nombreux mutants en raison de sa puissance intrinsèque plus élevée par rapport à 1.23 L’inhibiteur 37 n’a montré aucun problème significatif dans le test in vitro CYP ou hERG. Contrairement à un composé précoce contenant P ′ fragment allylique, aucun conjugué glutathion ou acylglucuronide ont été observés chez 37 rats, chiens et singes, indiquant ainsi l’absence de problème de métabolites réactifs.Les données de liaison aux protéines plasmatiques (in vitro, hu) étaient essentiellement similaires à la fois pour 1 et 37. Ainsi, sur la base de toutes les études précliniques, et ayant amélioré la puissance (∼ 10 fois plus de 1), le profil pharmacocinétique exposition de singe et de rat), et les caractéristiques physicochimiques (cristallin, isomère unique), l’inhibiteur 37 a été avancé comme candidat au développement.La liaison de 37 au site actif a été confirmée par la structure cristalline aux rayons X du complexe lié à la protéase (Figure ​ (Figure2) .2). Comme décrit précédemment, la région centrale (P3 − P ′) de l’inhibiteur 37 était liée à la protéase via une série de liaisons hydrogène et d’interactions hydrophobes.11 Le fragment cyclohexyle P4 nouvellement introduit a été positionné de façon appropriée pour un contact hydrophobe supplémentaire avec l’enzyme poche S4. En outre, l’un des atomes d’oxygène sulfone P4 était à proximité étroite pour l’interaction de liaison hydrogène avec Cys-159. Ces deux interactions favorables supplémentaires avec l’enzyme ont entraîné une puissance améliorée. La structure de la radiographie et le profil de 37. En conclusion, nos efforts vers l’identification d’un inhibiteur de la protéase du VHC NS3 de deuxième génération ont été initiés sur la base du sulfone P4. inhibiteur, 3, présentant une bonne activité de réplicon, une bonne exposition au singe mais une faible PK de rat. Introduction de P ′ Le fragment allylamide, avec des modifications concomitantes de P1, a entraîné l’inhibiteur 41, avec une exposition accrue chez le rat, tout en conservant la PK de singe. Puisque le remplacement du groupement allyle était nécessaire pour atténuer tout problème toxicologique potentiel, des efforts concertés ont été dirigés vers l’identification d’un non-oléfine approprié contenant P ′ résidu. Ces études ont été réalisées sur un inhibiteur contenant de la norleucine P1, en tant qu’isomère unique. P ′ Le cyclopropylamide s’est avéré être le groupe optimal donnant le composé 37, avec une amélioration de 10 fois de la puissance du réplicon sur 1. De plus, 37 ont montré une très bonne exposition du rat et une amélioration significative de l’exposition du singe par rapport à 1. Inhibitor 37 était bien réparti dans l’organe cible (foie de rat C8h / EC90 ∼ 25). La structure cristalline aux rayons X du complexe protéase inhibiteur (37) − a révélé l’importance de la fraction cyclohexyle coiffée de sulfone P4 pour améliorer la puissance. L’optimisation de la séquence synthétique a conduit à une voie qui ne nécessitait pas de purification de gel de silice pour la totalité de la synthèse, 37 étant obtenue sous une forme cristalline, résolvant ainsi une exigence de développement clé. Ayant satisfait à tous les critères établis pour un inhibiteur de la sérine-protéase NS3 / 4A du VHC de deuxième génération, 37 a été avancé pour d’autres études toxicologiques et s’est avéré sans danger.24 L’inhibiteur 37 fait actuellement l’objet d’études cliniques de phase II chez l’homme. none