Comparaison des méthodes de quantification de l’ARN du VHC du virus de l’hépatite C chez les patients co-infectés par le VHC et le virus de l’immunodéficience humaine

Quantification du virus de l’hépatite C L’ARN du VHC est important dans l’évaluation de la maladie hépatique associée au VHC chez les patients co-infectés par le VHC et le virus de l’immunodéficience humaine VIH Pour déterminer si l’intégrité standard des méthodologies de test concurrentes pourrait être compromise par des titres plus élevés. un essai basé sur la réaction en chaîne de la polymérase [essai COBAS Amplicor; Roche Diagnostics] et un test d’ADN à chaîne ramifiée [Versant; Bayer] ont été évalués en testant des échantillons sériques appariés de patients co-infectés et de patients monoinfectés par le VHC. Bien que la corrélation soit hautement significative r =; P & lt; les titres d’ARN du VHC exprimés en unités internationales par millilitre n’ont pas pu être standardisés; des différences statistiquement significatives ont été observées dans tous les quartiles Variabilité significative P & lt; On a observé que la normalisation dans les unités internationales avait une faible efficacité chez les patients co-infectés. Les cliniciens devraient noter que la variabilité du test exclut la comparabilité directe des titres d’ARN du VHC, en particulier chez les patients co-infectés avec des titres élevés

Le VHC peut être détecté indirectement par des méthodes sérologiques, par exemple EIA ou immunoblot recombinant, ou par un test direct de la présence d’ARN du VHC, bien que l’EIA soit détectée indirectement par le virus de l’hépatite C. Pour cette raison, de nombreux cliniciens peuvent choisir d’utiliser le test d’ARN du VHC comme test initial ou de confirmation ou pour les patients dont les antécédents d’exposition au risque suggèrent Probabilité accrue d’infection par le VHC Les tests quantitatifs d’ARN du VHC permettent à la fois la détection et le dénombrement, ce qui peut avoir une valeur pronostique en termes de résultats thérapeutiques. Deux technologies de test commerciales sont couramment utilisées aux États-Unis. Des dosages sont également disponibles. Un de ces tests commerciaux, le test d’ADN bADN ramifié Versant HCV RNA, versi sur ; Bayer, repose sur l’utilisation de l’amplification du signal, tandis que l’autre test utilise la PCR pour amplifier les parties cibles du génome du VHC COBAS Amplicor, version; Roche Diagnostics Les patients co-infectés par le VHC et le VIH ont des taux de VHC plus élevés que les patients immunocompétents Cette observation peut être particulièrement pertinente dans la population coinfectée car les caractéristiques du test sont optimisées pour les patients infectés par le VHC. Infection par le VHC seul En outre, l’utilisation d’une norme internationale de l’OMS pour la quantification du VHC a récemment été mise en œuvre pour réduire la variabilité intertest rendant difficile la comparaison des résultats entre technologies d’essai. en termes de titres d’ARN du VHC, exprimés en unités internationales par millilitre et en copies par millilitre, dans des échantillons provenant de patients co-infectés A titre comparatif, les caractéristiques du test au sein d’un groupe de patients infectés par le VHC seul ont également été évaluées

Patients et méthodes

Population étudiée Des échantillons de plasma provenant d’une cohorte VIH représentative distribuée au niveau national ont été obtenus dans le cadre d’études cliniques sur le SIDA chez l’adulte. Ces études étaient des essais de thérapie antirétrovirale hautement active pour l’infection par le VIH. Tous les échantillons ont été prélevés avant l’administration du traitement antirétroviral hautement actif. La collecte des échantillons a été effectuée après l’approbation du comité d’examen institutionnel et le consentement approprié du patient, y compris le consentement pour stocker les échantillons, a été obtenu dans tous les sites. aliquotes, et congelés à – ° C dans h de la collecte, conformément aux procédures de routine de collecte des virus. Lorsque des aliquotes mL étaient disponibles, le test apparié était effectué avec des aliquotes séparées Lorsque seul un aliquot était disponible, un seul cycle de congélation-décongélation était requis. des échantillons ont été utilisés pour les tests, et les données démographiques ont été e obtenu à partir d’un site central de données, garantissant la confidentialité A des fins de comparaison, une collecte aléatoire d’échantillons de patients infectés par le VHC seul a également été utilisée. Les échantillons ont été prélevés conformément à la méthodologie susmentionnée pour la conservation du virus. Ces échantillons comprenaient des échantillons obtenus pendant l’évaluation clinique pour le traitement et pendant le traitement avec des thérapies à base d’IFN Aucune évaluation spécifique ou protocole de traitement n’a été associé à la collecte de ces échantillons Données démographiques pour ce groupe n’étaient pas disponiblesHCV ARN ARN du VHC a été évaluée par des tests, qui ont tous deux été effectués à l’Université de Cincinnati College of Medicine et son laboratoire clinique affilié; les tests ont été effectués par des techniciens formés et certifiés par les fabricants de tests Un test d’ADN binaire Versant HCV RNA, version a été réalisée selon les instructions du fabricant Cette version mise à jour du test, qui utilise la méthodologie d’amplification du signal d’acide nucléique, a été modifiée sensibilité, par rapport aux versions décrites précédemment En bref, après extraction du sérum ou du plasma, l’ARN viral a été capturé à un micropuits à l’aide d’un ensemble de sondes de capture non traduites et de région de base hybridation de préamplificateur, amplificateur et phosphatase alcaline. des sondes marquées ont conduit à une amplification du signal, qui a été quantifiée par chimiluminescence. La concentration de l’échantillon a été déterminée à partir d’une courbe standard générée avec des concentrations connues d’ADN de phage monocaténaire recombinant. Les données ont été exprimées en millilitres et en unités internationales par millilitre. La plage de déclaration du test est – ,, copies / mL, ou – ,, IU / Test PCR mLA COBAS Amplicor HCV Monitor, version; Roche Diagnostics actuellement utilisé dans de nombreux sites cliniques a également été évalué. Les caractéristiques de ce test dans le test de patients infectés par le VHC seul ont été rapportées e test a également été effectué conformément aux instructions du fabricant. précipitation à l’éthanol Un standard de quantification du nombre de copies connu a été ajouté à chaque échantillon pour permettre une quantification précise. La transcription inverse et l’amplification PCR de l’ARN cible du HCV et du standard de quantification du VHC interne, suivies de la détection colorimétrique, ont été réalisées avec l’analyseur COBAS Amplicor. Les résultats ont été rapportés en millilitres. Les lots de production les plus récents des kits de test Amplicor sont standardisés par rapport aux normes internationales de l’OMS pour l’ARN du VHC, générant des plages de rapports en unités internationales par millilitre et comprenant la conversion des données par millilitre. est spécifique au kit l La plage de rapport de la version actuelle est -, UI / mL, avec une conversion approximative spécifique du kit de test en – ,, copies / mL Échantillons d’échantillons dépassant la limite supérieure de la plage de rapport du test Amplicor & gt ;, UI / mL Les résultats des tests de chaque essai ont été comparés dans et entre les groupes en utilisant des méthodes paramétriques et non paramétriques appropriées. Les titres viraux moyens ont été comparés en utilisant le test t de Student apparié et l’analyse de la variance, et les titres médians des virus ont été comparés. Une comparaison de Wilcoxon Pearson a été utilisée pour comparer des résultats d’échantillons appariés. Des comparaisons catégorielles ont été faites avec le test exact de Fisher. Des échantillons sélectionnés prélevés chez des patients présentant des titres faibles et élevés ont été dosés pour déterminer la variabilité interne des dosages. gammes Tous les essais de dosage liés à la partie répétée de l’étude ont été effectués par lots, par type d’essai, à des jours différents La signification statistique a été évaluée par une hypothèse en-queue avec une valeur α de

Résultats

Échantillons d’étude et données démographiques Les échantillons plasmatiques obtenus à partir de patients co-infectés ont été testés de manière appariée par les deux tests virologiques. En outre, les patients infectés par le VHC seuls ont été évalués pour comparaison. Cinquante pour cent des patients étaient blancs et% étaient noirs et non hispaniques La majorité a cité des antécédents de consommation de drogues injectables ou d’hémophilie, l’antécédent d’utilisation de concentrés de facteurs étant la principale association à risque. Le taux moyen d’ARN du VHC dérivé de l’utilisation de l’analyse d’ADN b était de × copies / ml. , le titre moyen du virus était × copies / mL Un test t apparié a révélé des différences significatives entre les groupes P =, tout comme le e test de Wilcoxon non-paramétré à un niveau signé P & lt; La conversion des unités en unités internationales normalisées par millilitre a conduit à un titre de virus moyen calculé de × UI / mL pour le test ADNb et de × UI / mL pour le test PCR. Cette différence était également significative selon les tests paramétriques et non paramétriques. Pour le test d’ADN b, la détermination de l’association de copies par millilitre avec des unités internationales par millilitre a révélé une corrélation de%, parce que l’une est une fonction directe de l’autre. corrélation directe entre les copies par millilitre et unités internationales par millilitre était la comparaison directe des numéros de copie de l’ADNb et les tests PCR ont conduit à une corrélation de Log conversion des copies par millilitre n’a pas modifié de manière significative la corrélation r = d’intérêt, la corrélation entre pas significativement améliorée par l’utilisation d’unités internationales par millilitre r = ou log unités internationales par millilitre r = Bien que Toutes les corrélations étaient hautement significatives P & lt ;, le diagramme de dispersion de ces résultats a révélé que les résultats individuels des patients étaient assez variables. En outre, il apparaissait que bien que la corrélation soit élevée, les titres réels des virus étaient exprimés en unités internationales par millilitre. , étaient significativement différentes Pour évaluer la relation entre les résultats des tests des échantillons appariés dans des intervalles discrets, nous avons déterminé les valeurs quartiles pour chaque test, divisant l’échantillon en ensembles de données de taille égale n = La valeur moyenne pour chaque quartile et les tests de PCR

Figure Vue grandDownload Diagramme de dispersion transformé en log montrant une comparaison de l’ADN bADN ramifié et des tests de PCR effectués sur des échantillons obtenus de patients infectés par le virus de l’hépatite C VHC et VIH et de patients infectés par le VHC seul; Diagramme de dispersion transformé en log montrant une comparaison de l’ADN bADN ramifié et des tests PCR effectués sur des échantillons provenant de patients infectés par le virus de l’hépatite C VHC et VIH et provenant de patients avec infection par le VHC seul; n = Les données sont exprimées en unités internationales par millilitre, la ligne de régression idéale étant indiquée

Comparaison interquartile de l’ADN bADN ramifié et des tests PCR pour le virus de l’hépatite CTable View largeDownload Comparaison interquartile de l’ADN bADN ramifié et des tests PCR pour le virus de l’hépatite C Une autre analyse se concentre sur le% central de l’ensemble de données. les extrêmes En utilisant cette analyse alternative, le titre moyen du virus était de « UI / mL pour le test d’ADNb et » UI / mL pour le test PCR P & lt Dans la pratique clinique, un seuil de valeur unique est souvent utilisé pour définir la différence entre les titres de virus faibles et élevés En utilisant l’analyse de l’ADN b, les titres viraux de% de nos échantillons étaient inférieurs à × copies / ml. En revanche, en utilisant le test PCR, les titres de% des échantillons étaient inférieurs à Cette valeur critique des échantillons ayant des titres viraux inférieurs à × copies / ml par PCR, seuls des% des virus présentaient des titres viraux inférieurs à × copies / mL par le test ADNb. Par conséquent, bien que des pourcentages similaires soient inférieurs à Les tests catégoriels avec le test exact de Fisher ont montré des différences significatives entre les tests en ce qui concerne la classification associée à cette valeur seuil. P = La même analyse a été faite avec l’utilisation d’un seuil de, IU / mL, qui a été associé à un mauvais pronostic de la réponse au traitement. Le pourcentage de titres de virus de l’échantillon d’ADN bAD était inférieur à ce niveau, alors que les résultats de PCR ont révélé que seulement% des titres étaient inférieurs à cette valeur. Pour déterminer si la discordance observée chez les patients infectés par le VIH est pertinente pour les patients infectés par le VHC seuls, des comparaisons appariées ont été faites entre les titres de virus dans des échantillons uniques obtenus à partir de patients infectés par le VHC. patients Parce que le fabricant du test PCR Roche n’a pas fourni un moyen de conversion des copies par millilitre à unités internationales par millilitre avec la libération précoce du test Amplicor, la comparaison appariée des titres exprimés en unités internationales par millilitre était possible pour un sous-ensemble n = d’échantillons. Le système de dosage basé sur la PCR détectait le virus dans les échantillons inférieurs à la limite de détection. l’analyse de l’ADN b% Le titre moyen du virus déterminé par l’analyse de l’ADNb était de x copies / ml. En revanche, le titre moyen du virus déterminé par PCR était de x copies / ml P & lt; La conversion des données des copies par millilitre en unités internationales par millilitre a donné des titres moyens de virus de, UI / mL et, UI / mL pour les tests d’ADNb et de PCR, respectivement P = La corrélation globale entre les tests d’ADNb et de PCR était unités internationales par millilitre P =, mais la conversion du logarithme a augmenté cette corrélation à P & lt; L’analyse par quartile, qui divisait la cohorte en groupes de patients faibles à élevés des patients inclus dans le groupe quartile, a également été effectuée. Les corrélations dans chaque quartile étaient P =, P =, P =, et – P = Ainsi, la seule la corrélation était dans le deuxième quartile avec des plages de, -, UI / mL pour le test ADNb et, – ,, UI / mL pour le dosage PCRAssay comparaison pour des cohortes groupées et des échantillons répliqués Lorsque tous les échantillons appariés testés étaient combinés n =, la corrélation entre les dosages des titres de virus présentés en unités internationales par millilitre était P & lt; Ceci a augmenté lorsque la comparaison des appariements logarithmiques a été faite. Les statistiques sommaires globales ont démontré un titre moyen ± ET, ± UI / mL médiane, UI / mL pour le test d’ADNb Pour le test PCR, le titre moyen ± SE était ± , UI / mL médiane, UI / mL Un diagramme de dispersion log-transformé et une droite de régression idéale sont montrés dans la figure. Des échantillons avec des titres viraux plus élevés ont démontré un schéma évasé qui semble être associé à la dérivation de l’échantillon, c.-à-d. sur des échantillons pour déterminer la variabilité intra-test de chaque test Les échantillons ont été sélectionnés sur la base d’une classification arbitraire en tant qu’échantillons à titre faible ou élevé, et – les réplicats ont été dosés par échantillon Les moyennes, écarts-types et coefficients de variation dans la figure Il y avait un très petit coefficient de variation pour l’essai d’ADNb quand les titres de virus étaient relativement bas. En termes de variabilité, les résultats des deux essais en ce qui concerne le spécimen de titre supérieur semblaient être compa rable

Figure Vue largeDownload variabilité de l’ADN bADN ramifié et des tests PCR pour l’ARN du VHC du virus de l’hépatite C en utilisant des colonnes à titre bas et des colonnes et des échantillons à titre élevé Les données sont exprimées en unités internationales par millilitre; la valeur moyenne ± SD est montrée, et le coefficient de variation pour chaque type d’essai est donné. Variabilité de l’ADN bADN ramifié et de la PCR pour l’ARN du VHC du virus de l’hépatite C en utilisant des colonnes à titre bas et à titre élevé. colonnes et échantillons Les données sont exprimées en unités internationales par millilitre; la valeur moyenne ± écart-type est indiquée et le coefficient de variation pour chaque type de dosage est indiqué

Discussion

Il incombe aux prestataires de soins de santé cliniciens de choisir une méthode d’essai et de s’assurer que cette méthode est utilisée pendant toute la durée du traitement. Cette sélection sera basée sur la disponibilité, le coût et les caractéristiques du test. patients Par exemple, si un patient classé comme «non-répondeur au traitement» commence à recevoir un traitement d’entretien, l’utilisation d’un test à faible coefficient de variation permettra un meilleur discernement de la réponse au traitement, en particulier par incréments de b – et les tests basés sur la PCR démontrent que les patients co-infectés ont des charges virales relativement élevées, comme cela a été décrit précédemment En termes de tests, les implications de cette découverte sont liées aux caractéristiques des tests étudiés. plafond dans sa plage linéaire effective Par conséquent, un pourcentage important d’échantillons doit être dilué avant de procéder aux essais. Dilution représente théoriquement l’ajout d’une variable qui augmente la variabilité des résultats de l’échantillon à des charges virales plus élevées. Cependant, les données présentées ici démontrent une divergence. de la corrélation à des titres viraux élevés, qui semble être plus liée à la présence ou à l’absence de VIH qu’au titrage viral lui-même. L’examen des données regroupées à l’aide d’une échelle log-transformée suggère que la corrélation inter-essai est relativement intacte condition. / mL pour les échantillons provenant de patients co-infectés et de patients infectés par le VHC seuls. À ce stade, les patients infectés par le VHC ont une relation altérée, avec des titres viraux plus faibles enregistrés dans les tests PCR. les patients sont évalués La raison en est peu claire Les résultats peuvent représenter la variabilité du lot dans le P Pour déterminer si la variabilité du lot et le multiplicateur associé pour la conversion des unités internationales m × UI / mL = copies / mL étaient des facteurs importants , nous avons stratifié les échantillons en groupes en utilisant le facteur de correction spécifique au kit – Le plus grand multiplicateur m a été utilisé pour le groupe monoinfecté, ce qui suggère que les titres viraux exprimés en unités internationales sont plus faibles pour ce groupe avec la cohorte co-infectée, sur la base de la variabilité du lot La variation intertest de la corrélation n’a pas été observée pour les versions d’ARN du VIH de ces tests es versions précédentes du test ADN ont été comparées au PCR. conversion mathématique pour permettre la comparabilité de nombre de copies a été décrit lus inquiétant que la divergence de corrélation est le manque d’accord pauvre Le but de la norme de l’OMS était de permettre une comparaison directe et fiable des taux d’ARN du VHC, quel que soit le type de test. Nos données démontrent clairement le haut degré de variation actuelle La raison de cette variabilité n’est pas claire. Probablement liée à la méthodologie utilisée pour déterminer la relation entre les étalons et les étalons internes. L’étalon OMS a été dérivé d’un échantillon de génotype lyophilisé accepté comme étalon candidat et attribué un titre d’IU / mL e cette norme, différentes méthodes peuvent être employées pour relier cette valeur au dosage existant. Les implications de cette découverte sont que les cliniciens doivent rester au courant de la méthode de dosage employée en suivant des patients pendant un cours de thérapie et que la maintenance de méthodologies de test identiques optimisera l’évaluation des résultats individuels des patients. Chez les patients ayant des titres viraux faibles, cet effet est relativement minime, mais une forte variabilité peut entraîner une mauvaise fiabilité lors de l’évaluation de la réponse au traitement. Bien que les patients co-infectés aient peu de titres viraux avant le traitement, L’incapacité à détecter des taux d’ARN du VHC plus bas peut mener à de fausses déclarations de clairance du virus à la fin d’une thérapie et peut nécessiter l’utilisation d’un supplément d’ARN du VHC. À cet égard, des rapports récents suggèrent que l’amplification médiée par la transcription peut identifier un sous-ensemble significatif de patients avec un virus détectable à la fin du traitement ar conséquent, une combinaison de méthodes d’essai peut être nécessaire pour optimiser la gestion des patients atteints de HC Infection V

Remerciements

Nous remercions Natasa Rajicic pour son aide dans la caractérisation de la cohorte co-infectée et Janet Anderson pour la revue statistique critique