ARN Rhinovirus dans l’épithélium sinus maxillaire des patients adultes atteints de sinusite aiguë

Nous avons utilisé l’hybridation in situ pour la détection de rhinovirus dans des prélèvements de sinus maxillaires chez des patients adultes atteints de sinusite aiguë. Dans des échantillons, l’ARN du rhinovirus a pu être démontré dans l’épithélium sinusien maxillaire confirmant ainsi l’étiologie du rhinovirus et la suspicion clinique de sinusite aiguë.

L ‘objectif de la présente étude était de déterminer, par hybridation in situ, si l’ ARN du rhinovirus peut être détecté dans l ‘épithélium du sinus maxillaire de patients adultes présentant une sinusite aiguë. – années] et l’homme [âge, années] avec des diagnostics de sinusite aiguë communautaire ont été étudiés de janvier à mai au département d’oto-rhino-laryngologie du CHU d’Helsinki. Pour chaque cas, le diagnostic était basé sur les résultats cliniques. Les symptômes observés au moment de l’admission étaient les suivants: obstruction nasale, rhinorrhée purulente, douleur faciale et / ou fièvre. Un patient avait reçu un diagnostic de sinusite et / ou d’aggravation de la sinusite. une pneumonie lobaire gauche une semaine avant l’admission, et un autre patient a eu un diagnostic d’otite moyenne plusieurs jours avant l’admission; Chez tous ces patients, un traitement antibiotique avait été instauré pendant la période de soins primaires. Pour tous les patients, la durée des symptômes de sinusite était de ⩽ semaines. Les patients pour lesquels des problèmes de sinusite chronique et / ou de sinusite récidivante étaient suspectés ont été exclus de l’étude. étaient des patients qui avaient des antécédents de rhinite allergique ou d’asthme. En outre, les conscrits masculins du département d’Oto-rhino-laryngologie de Helsinki ont été étudiés et ont subi une ponction sinus maxillaire pour une sinusite maxillaire aiguë en mars. Aux radiographies, un total de patients présentaient des modifications liées à la sinusite, soit une modification du niveau d’air-fluide, soit une opacité totale des sinus maxillaires. La radiographie du sinus n’a pas été réalisée chez tous les patients. antibiotique par voie orale habituellement de l’amoxicilline pendant plusieurs jours Une visite de suivi a été prévue une semaine après le début du traitement; par la suite, des visites ont eu lieu une fois par semaine si les symptômes persistaient. Un spécimen de biopsie sinus maxillaire a été obtenu lorsque le patient atteint d’exophtalmie due à la maladie de Basedow Morbus a subi une chirurgie de décompression orbitaire, et ce spécimen servait de témoin pour l’épithélium du sinus maxillaire non infectieux. cavité sous le cornet inférieur, et une petite pince a été passée à travers l’aiguille Un seul spécimen de biopsie sinus maxillaire a été recueilli par patient Chaque spécimen a été placé dans du formol, puis a été inclus dans la paraffine, coupé et fixé sur les lames de microscope. des échantillons de biopsie, un lavage antral avec une solution saline a été réalisé pour chaque patient. La région génétique représentant les nucléotides partiels – du rhinovirus de type rhinovirus – ‘région non traduite’ UTR a été amplifiée par PCR à partir d’un gabarit d’ADN complémentaire et a été clonée dans pGEM-Z plasmide Promega entre les sites HindIII et XbaI Le fragment nucléotidique a été cloné dans les deux orientations sous le contrôle du promoteur T Des sondes d’ARN marquées à la digoxigénine ont été synthétisées en utilisant la T ARN polymérase et le kit de marquage DIG RNA Roche Des sections de cinq millimètres d’épaisseur pour l’hybridation in situ ont été montées sans ribonucléase sur des lames Super Frost thermo-traitées Menzel-Gläser L’hybridation in situ a été réalisée en utilisant le dispositif de coloration automatisé Gen II Ventana Medical Systems pour hybridation in situ / immunohistochimie Le programme utilisé était le protocole « Ventana Regular » Les sections ont d’abord été déparaffinées en changements de xylène pendant min. Après avoir été rincés dans de l’eau distillée traitée avec% de diéthylpyrocarbonate, les lames ont été conservées dans une solution de phosphatase alcaline Ventana Medical Systems Les sections ont été traitées avec le réactif Protease Ventana Medical Systems pendant min avant l’hybridation à ° C. pour – h Le mélange d’hybridation contenait% formamide et × standa SSC citrate salin SSC Après l’hybridation, les lavages ont été effectués à ° C pendant min. × SSC, × SSC, et × SSC anticorps monoclonal antidigoxigénine Clone DI-; Sigma a été incubé avec les coupes pendant min. La sonde a été détectée avec le kit de détection de la ‘- diaminobenzidine tétrahydrochlorure biotine avidine DAB de base; Ventana Medical Systems Les sections ont été déshydratées et montées avec des lamelles avec Eukitt O Kindler, GmbH, et elles ont été analysées à l’aide d’un microscope optique Olympus. Au début, les sondes rhinovirus ont été testées à la fois chez les rhinovirus infectés et chez les rhinovirus non infectés. cultures cellulaires in vitro La figure montre des exemples de cellules HeLa infectées par rhinovirus et rhinovirus non infectées Des signaux positifs ont été trouvés dans le cytoplasme de cellules HeLa infectées en utilisant la sonde antisens figure A, mais ils n’ont pas été détectés par l’utilisation de la sonde sens données non montrées Les cellules HeLa non infectées ont été testées négatives pour le rhinovirus – en utilisant la sonde antisens figure B et les données de sonde de détection non montrées

Figure Vue largeDownload hybridation in situ des cellules HeLa infectées par des rhinovirus de type rhinovirus – Les cellules HeLa infectées par rhinovirus-A ou les cellules témoins non infectées B ont été récoltées après h, ont été fixées et ont été incorporées dans la paraffine Hybridation in situ a été réalisée avec une sonde antisens rhinovirus Dans le panel A, le signal positif est vu comme une couleur brune cytoplasmique. Bar = μmFigure View largeDownload hybridation in situ de cellules HeLa infectées par des rhinovirus de type rhinovirus – des cellules HeLa infectées par des rhinovirus-A ou des cellules témoins non infectées B ont été récoltées après h, ont été fixées, et ont été incorporés dans la paraffine. L’hybridation in situ a été réalisée avec une sonde antisens rhinovirus. Dans le panneau A, le signal positif est vu comme une couleur brune cytoplasmique Bar = μmBy hybridation in situ avec la sonde antisens figure A – mais pas avec la sonde sens B- ARN de rhinovirus a été détecté à l’intérieur des cellules de l’épithélium respiratoire dans% des échantillons de biopsie du sinus maxillaire obtenus Des échantillons de biopsie de tous les patients traités pour une sinusite ont montré des signes histopathologiques d’une infection aiguë. Une dégénérescence épithéliale et une augmentation de la formation de mucus étaient évidentes, et les patients présentant une sinusite aiguë ne présentaient aucun signe de sinusite maxillaire. une augmentation de l’infiltration des cellules inflammatoires des muqueuses a été notée Figure C Des modifications inflammatoires n’ont pas été observées chez les patients du groupe témoin qui ont subi une intervention chirurgicale pour la maladie de Basedow de Morbus figure D

Figure Vue largeTaille de téléchargement Hybridation in situ pour rhinovirus type rhinovirus- dans les spécimens de biopsie sinus maxillaire A, Détection de rhinovirus-, sonde antisens, dans un spécimen de biopsie sinus maxillaire obtenu à partir du patient avec sinusite maxillaire Signal d’hybridation positif est visible comme réactivité brun cytoplasmique dans respiratoire cellules épithéliales B, section adjacente du même spécimen de biopsie, sondé avec une sonde sens rhinovirus, ne présente aucun signal d’hybridation C, spécimen de biopsie du sinus maxillaire négatif anti-rhinovirus-antisens obtenu chez un autre patient souffrant de sinusite aiguë D, Manque de rhinovirus – réactivité Spécimen de biopsie du sinus maxillaire obtenu à partir du sinus maxillaire d’un patient non infecté pendant la chirurgie de décompression Bar = μmFigure View largeToile de téléchargement Hybridation in situ pour rhinovirus type rhinovirus- dans les spécimens de biopsie sinus maxillaire A, Détection de rhinovirus, sonde antisens, dans un spécimen de biopsie sinus maxillaire obtenu du patient nt avec sinusite maxillaire Le signal d’hybridation positif est visible en tant que réactivité brun cytoplasmique dans les cellules épithéliales respiratoires B, section adjacente du même échantillon de biopsie, sondé avec une sonde rhinovirus-sens, ne présente aucun signal d’hybridation C, spécimen de biopsie maxillaire négatif négatif au rhinovirus antisens d’un autre patient atteint de sinusite aiguë D, Manque de rhinovirus-réactivité dans un prélèvement de sinus maxillaire prélevé sur le sinus maxillaire d’un patient non infecté lors d’une chirurgie de décompression Bar = μmDans cette étude, nous avons montré que l’ARN des rhinovirus peut être trouvé dans les cellules épithéliales Des études épidémiologiques ont montré que l’excrétion de rhinovirus dans le liquide nasal persiste pendant plusieurs semaines chez les patients souffrant de rhumes dus au rhinovirus . Malheureusement, les patients atteints de rhinovirus ne présentent pas de sinusite maxillaire. , nous n’avons pas obtenu de spécimen de biopsie du sinus maxillaire en phase convalescente s de nos patients; Cependant, dans une récente étude expérimentale des voies respiratoires inférieures, il a été montré que des échantillons de biopsies bronchiques restaient positifs pour le type de rhinovirus in situ pendant – semaines après une infection rhinovirale induite expérimentalement La possibilité que, pour certains de nos patients, rhinovirus – représenterait une infection antérieure, plutôt qu’une infection aiguë, ne peut pas être exclue; Cependant, les patients souffrant de sinusite chronique et les patients présentant des problèmes de sinusite récurrents n’ont pas été inclus dans notre étude. D’autre part, il est possible qu’une combinaison de rhinovirus couvrant plusieurs sérotypes ait augmenté la sensibilité du protocole d’hybridation in situ du rhinovirus. Dans cette étude, aucun test n’a été effectué pour déterminer dans quelle mesure la sonde rhinovirus réagissait avec d’autres rhinovirus appartenant à la même grappe génétique. un grand nombre de cellules épithéliales sinusales positives pour le rhinovirus est en contraste avec les résultats d’une étude antérieure , dans laquelle seul un petit nombre de cellules de l’épithélium nasal ont été déterminées comme positives pour le rhinovirus par hybridation in situ. résultat d’une variation individuelle, d’une situation épidémiologique ou des différences entre la sinusite clinique et le rhin expérimental. infection à ovirus Nous concluons que la démonstration directe de l’ARN du rhinovirus in situ apporte la preuve de la présence du rhinovirus dans les cellules épithéliales respiratoires du sinus maxillaire chez les patients adultes atteints de sinusite aiguë.

Remerciements

Nous remercions le Dr Maija Hytönen pour l’obtention de l’échantillon de biopsie du sinus maxillaire lors d’une chirurgie de décompression chez le patient atteint de la maladie de Morbus Basedow. Nous remercions Leena Palmunen, Riitta Heino et Tuula Halmesvaara pour leur expertise technique