Apparition aiguë d’un diabète sucré de type I après une infection sévère à Echovirus: voies pathogènes putatives

Les infections à entérovirus ont été impliquées dans le développement du diabète sucré de type I Elles peuvent provoquer la destruction des cellules β soit par une infection cytolytique du pancréas, soit indirectement en contribuant à la réactivité auto-immune. Le virus a été isolé et administré à des cellules β humaines cultivées Aucune prolifération virale n’a été observée et aucune mort cellulaire β n’a été induite, tandis qu’une exposition parallèle au sérotype du virus Coxsackie B a entraîné une prolifération virale et une mort massive des cellules β. C a présenté une séquence similaire à celle de l’autoantigène β cellule glutamic acide décarboxylase GAD, aucune réponse des cellules T réactives croisées ont été détectées Le patient n’a pas développé d’anticorps contre GAD soit Absence de preuve d’action cytolytique directe ou un effet indirect par mimétisme moléculaire avec GAD dans la présente affaire soulève la possibilité d’une autre voie directe à travers laquelle les entérovirus peuvent causer le diabète sucré

L’incidence du diabète sucré insulino-dépendant de type I augmente rapidement dans de nombreuses régions du monde occidental Des études incluant des jumeaux monozygotes indiquent clairement que les facteurs environnementaux jouent un rôle en plus de la susceptibilité génétique de la maladie . La maladie implique des mécanismes auto-immuns avec des facteurs de risque environnementaux qui contribuent à déclencher l’auto-immunité ou à accélérer la destruction des cellules β , L’infection par les entérovirus, principalement les CVB des virus Coxsackie B , constitue l’un des principaux facteurs environnementaux. Cependant, le sérotype CVA du virus Coxsackie A et plusieurs sérotypes d’échovirus ont également été associés au développement de DM de type I Des études de cas ont montré que les entérovirus peuvent en effet causer une DM aiguë . De plus, ces études ont montré que la séroconversion ou l’élévation des autoanticorps dirigés contre les antigènes des îlots de Langerhans étaient temporairement liées à l’infection par les entérovirus, suggérant que l’infection virale déclenche l’auto-immunité aux cellules β pancréatiques [ La manière dont les entérovirus peuvent déclencher l’auto-immunité et l’apparition de DM de type I n’est pas claire Plusieurs mécanismes qui ne s’excluent pas mutuellement D’abord, l’infection entérovirale dans le pancréas peut provoquer une lyse directe des cellules β par le cycle de vie cytotoxique du virus. ,] Deuxièmement, les cellules T peuvent interagir, ce qui se produit lorsque les antigènes viraux et les auto-antigènes partagent antigène Sur la base de la similarité de séquence dans la protéine CVB C et dans l’antigène de cellule β glutamique acide décarboxylase GAD, une réactivité croisée putative a été suggérée comme étant impliquée dans le développement de DM de type I En outre, comme le démontrent les modèles animaux, les infections virales peuvent activer les lymphocytes T potentiellement autoréactifs , un processus décrit comme une activation du spectateur Alternativement, les infections virales peuvent induire localement la production de cytokines et d’autres médiateurs inflammatoires qui peuvent affecter directement les cellules β effets toxiques La première voie n’implique pas nécessairement des réponses auto-immunes; Cependant, à la suite des dommages aux cellules β et de l’absorption des antigènes par les cellules présentatrices d’antigènes, la réactivité aux composants cellulaires β pourrait bien survenir. Nous avons étudié le rôle des entérovirus dans le développement du DM de type I chez une fille au cours d’une infection sévère généralisée par un échovirus EV Le virus a été isolé et testé pour son effet cytotoxique sur des cellules β humaines isolées d’organes donneurs. La susceptibilité génétique de l’enfant a été évaluée par typage HLA Séquençage de la région codante de la protéine virale C pC homologie de séquence avec GAD La réactivité croisée entre pC et GAD a donc été étudiée par un test de prolifération des lymphocytes T Après résolution de l’infection et stabilisation de son état diabétique, l’enfant a testé la présence d’autoanticorps contre les antigènes des cellules des îlots. cellules

Patient, matériaux et méthodes

L’isolat de sérotype CVB cal et le virus dérivé du clone d’ADNc infectieux provenant de la souche CVB du sérotype CVB Nancy [pc] ont été propagés sur des cellules Vero; Ces isolats ont été utilisés pour la comparaison. Les cellules ont été cultivées dans du milieu essentiel minimal additionné de sérum fœtal bovin% .Isolation de l’ARN viral et analyse de séquence L’ARN viral a été extrait après un seul passage du virus par le thiocyanate de guanidinium-phénol-chloroforme selon la méthode de Chomczynski et Sacchi La transcriptase inverse et les analyses PCR de la région ‘non traduite et du génome pC ont été réalisées comme décrit précédemment La séquence pC codant pour la région avec homologie avec GAD a été analysée par analyse de séquence. Les îlots pancréatiques ont été isolés à partir de donneurs humains, et âgés de plusieurs années comme décrit précédemment Les suspensions d’îlots ont été obtenues par dissociation de cellules fraîchement isolées dans un milieu sans calcium avec de la trypsine et de la désoxyribonucléase. cellules ont été recueillies après le tri cellulaire activé par autofluorescence Cette procédure a abouti à la culture Les cellules purifiées ont été cultivées dans des conditions sans sérum. Le milieu a été constitué de milieu GIBCO de Ham, F, Grand Island, NY, additionné de mM de L-glutamine, de μM -isobutyl-L-méthylxanthine, de g de pénicilline / L. , g de streptomycine / L, mM de glucose et g de sérumalbumine bovine traitée au charbon de bois / test de viabilité cellulaire Lβ Le pourcentage de cellules viables, nécrotiques ou apoptotiques a été évalué après culture en présence de virus. Le test de cytotoxicité était basé sur la coloration fluorescente des noyaux avec Hoechst Calbiochem-Novabiochem, La Jolla, CA et l’iodure de propidium Sigma, St Louis Les cellules apoptotiques ont été détectées par leurs noyaux fragmentés Les cellules β ont été infectées par EV à une multiplicité d’infection. par cellule ou sérotype CVB à une MOI de, ou TCID par cellule ou étaient réplication non infectéeVirus dans les cellules d’îlots Les courbes de croissance à cycle unique ont été déterminées par l’infection, les cellules des îlots pancréatiques avec t Les virus ont été titrés sur des cellules rénales de singe tertiaire dans des plaques bien comme décrit ailleurs Les valeurs TCID ont été calculées selon la méthode de Reed et Munch. Détermination de HLA HLA-DQA a été déterminée par des techniques PCR utilisant le kit d’analyse d’ADN HLA-DQalpha Forensis de type Ampli Perkin / Elmer, Branchburg, NJ selon les instructions du fabricant HLA-DQB a été déterminée comme décrit précédemment HLA-DR a été attribué par déséquilibre de liaisonAutoanticorps Des échantillons de sérum ont été obtenus du patient et des mois après le début de type I DM Les niveaux d’autoanticorps à la protéine tyrosine phosphatase IA- et l’antigène cellulaire des îlots ont été mesurés par des méthodes validées ailleurs d’anticorps dirigés contre un antigène GLIMA de la membrane des cellules des îlots glycosylés, qui, avec GAD et IA- marque la phase précoce de l’autoréactivité chez Les niveaux d’anticorps anti-GAD ont été déterminés en utilisant un test de liaison radio validé comme décrit ailleurs Tous les sérums ont été testés en triplicataLymphocyte proliferation assay Des cellules mononucléaires fraîches de sang périphérique PBMC ont été isolées par centrifugation Ficoll Ficoll-Paque, grade de recherche ; Amersham Pharmacia Biotech AB, Rozendaal, Pays-Bas et mois après le début des réponses des lymphocytes T DM de type I ont été mesurés par un test de prolifération lymphocytaire décrit par Schloot et al En bref, les PBMC ont été cultivées pendant plusieurs jours dans le milieu Dulbecco modifié d’Iscove. , Breda, Pays-Bas contenant% de sérum autologue La réactivité de l’antigène des PBMC a été testée en triple en présence de milieu pour mesurer la prolifération de fond, IL-% Lymphocult T, Biotest, Dreieich, Allemagne; contrôle positif, antigènes recombinants des îlots humains μg de IA- / mL et μg de GAD / mL, peptides GAD μg / mL, IA-peptides μg / mL, lysat cellulaire prélevé sur des cellules Vero infectées par le sérotype CVB, préparation de cellules faussement infectées, Après quelques jours d’incubation, la [H] -thymidine a été ajoutée aux cellules et l’incubation a été poursuivie pendant h. Les cultures ont été récoltées et l’incorporation de [H] -thymidine a été mesurée par comptage par scintillation liquide. en tant que médiane des résultats des tests, la réactivité était considérée comme significative si l’index de stimulation SI, cpm avec antigène / cpm sans antigène était ⩾Antigènes GAD recombinant humain et la région immunogène de IA- représentant acide aminé – ont été préparés comme décrit ailleurs [, Un panel de tables de peptides couvrant la séquence d’acides aminés homologues de GAD et CVB pC humaines ont été synthétisés par des stratégies en phase solide sur un synthétiseur de peptides multiples Abimed automatisé Abimed Analyses-Technik, Langenfeld, Germ tout

Tableau View largeTélécharger les peptides recouvrant la séquence commune à l’acide glutamique décarboxylase GAD et virus Coxsackie B sérotype CVB protéine C pC dans une étude de diabète de type I induite par un entérovirusTable View largeDownload Des peptides chevauchants couvrant la séquence commune à l’acide glutamique décarboxylase GAD et Coxsackie B On a préparé des lysats de cellules de Vero avec une dose élevée de sérotype MOI de sérotype CVB, TCID par cellule. Après que l’effet cytopathique complet a été atteint, les cellules infectées ont été collectées par les cellules Vero. Pendant ce temps, des cellules infectées ont été préparées. Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS et dissoutes dans du PBS, les cellules / μL Virus ont été libérées par cycles de congélation et décongélation. Cette procédure a donné un rendement viral de TCID / mL

Résultats

Infections virales de cellules d’îlots pancréatiques humaines cultivées Pour rechercher si le virus isolé présente un tropisme pour le pancréas et est capable de provoquer une destruction directe des cellules β pancréatiques, nous avons infecté des cultures de cellules d’îlots pancréatiques isolées de plusieurs donneurs humains dans un système in vitro. L’isolat du patient n’a pas induit de nécrose et de mort cellulaire β, alors que le sérotype CVB d’un entérovirus témoin n’a pas montré de signes d’apoptose après l’infection. avec EV ou CVB Pour étudier plus avant si le virus pourrait infecter et se répliquer dans les cellules β sans effets cytopathogènes sur la cellule hôte, la croissance de EV a été analysée dans des expériences séparées utilisant des cellules pancréatiques d’îlots provenant de différents donneurs. fraction cellulaire enrichie en cellules endocrines ou en fraction non endocrine Les résultats représentatifs sont montrés dans la figure En revanche, la quantité de CVB a augmenté de manière significative. Les résultats indiquent que le virus isolé du patient n’était pas capable d’infecter et de tuer les cellules ß pancréatiques.

Vue de la figure grandDownload slideNecrosis induit par les infections à entérovirus dans les cellules d’îlots humains cultivés à h, barre blanche; – h, barre grise; et – jours, barres hachurées, post-infection La moyenne des indices de nécrose pour des expériences séparées est montrée L’indice corrige la quantité de cellules nécrotiques dans les contrôles non-infectés Le pourcentage moyen de cellules β dans les îlots ± SD était de% ±% EV , échovirus; CVB, virus Coxsackie B; MOI, multiplicité d’unité d’infection de TCID par celluleFigure View largeDownload slideNecrose induite par des infections à entérovirus dans des cellules d’îlots humains cultivées à h, barre blanche; – h, barre grise; et – jours, barres hachurées, post-infection La moyenne des indices de nécrose pour des expériences séparées est montrée L’indice corrige la quantité de cellules nécrotiques dans les contrôles non-infectés Le pourcentage moyen de cellules β dans les îlots ± SD était de% ±% EV , échovirus; CVB, virus Coxsackie B; MOI, multiplicité de l’unité d’infection de TCID par cellule

Figure Une grande courbe de croissance représentative du sérotype du virus de l’échovirus et de Coxsackie B dans des cultures de cellules d’îlots humains à partir d’expériences indépendantes est montrée. La réplication des interférovirus dans des cellules d’îlots humains cultivées dans le cadre d’une étude sur le diabète sucré de type I induit par les échovirus Une courbe de croissance représentative du sérotype du virus de l’échovirus • et de la souche Coxsackie B chez l’humain La charge virale a été déterminée aux points temporels indiqués après l’infection. Noter que l’échelle est représentée comme une échelle logarithmique. Réactivités des anticorps Pour tester si l’auto-immunité a été déclenchée par l’infection virale, nous avons étudié la présence d’auto-anticorps chez le patient. et mois af On a testé les anticorps anti-IA, GAD et GLIMA qui sont des marqueurs précoces de l’auto-immunité et également des anticorps contre l’antigène des îlots pancréatiques. Toutefois, aucune réactivité à ces autoantigènes n’a été observée. Contexte génétique HLA typage des marqueurs de susceptibilité pour le type I DM a été réalisée certains allèles HLA se sont révélés se lier à un épitope croisé putatif que les virus analogues au CVB ont en commun avec le typage GAD HLA a révélé l’haplotype à haut risque HLA-DQ A * / B * -HLA-DR et l’haplotype protecteur HLA-DQ A * / B * -HLA-DR Mimétisme moléculaire Pour tester l’hypothèse de mimétisme moléculaire, la séquence pC virale a été analysée pour l’homologie avec GAD Le virus codait pour le motif PEVKEK, qui est partagé entre GAD et pC des entérovirus de type CVB avec quelques différences mineures dans les séquences flanquantes Figure La présence d’homologie de séquence dans un isolat EV a confirmé des observations antérieures montrant que les entérovirus et les CVB sont étroitement liés à un niveau moléculaire et que beaucoup de virus apparentés au CVB contiennent la séquence PEVKEK On a suspecté que les différences dans les séquences flanquantes n’affectaient pas la liaison de la séquence à HLA-DQ, sur la base du motif de liaison DQ décrit par Oiso et al.

Figure Vue largeTélécharger la séquence de la séquence de mimétisme moléculaire de la protéine EV cCP, du sérotype CVB pC et de l’acide glutamique décarboxylase hGAD humaine dans une étude sur le diabète sucré de type I induit par les échosomes. révèlent des acides aminés de polarité, d’hydrophobicité ou de charge similaires Les nombres se réfèrent au nombre de résidus d’acides aminés des terminaisons aminées de chaque protéineFigure, large alignement de la séquence de mimétisme moléculaire de la protéine EV de l’échovirus C pC, virus Coxsackie B et l’acide glutamique décarboxylase humaine hGAD dans une étude du diabète sucré de type I induit par les échovirus Les lignées continues renferment des résidus d’acides aminés identiques Les lignes pointillées révèlent des acides aminés de polarité, hydrophobicité ou charge similaires. de chaque protéineReactivité cellulaire réactivité des cellules T a été mesurée une d mois après le début de la maladie Le mimétisme moléculaire a été étudié en mesurant les réponses des lymphocytes T au GAD, aux peptides GAD et aux antigènes viraux. La prolifération mesurée en réponse au GAD ou aux peptides dérivés du GAD représentant les acides aminés -, -, et – Le tableau n’était pas différent de la prolifération de fond Faible réactivité SI, a été mesurée pour le peptide GAD représentant les acides aminés – au mois mais pas au mois La réactivité au CVB pC représentant les acides aminés – était aussi légèrement augmentée SI, mois mais pas mois figure CVB pC représentant les acides aminés – a été testé en mois seulement, et il n’y avait pas de prolifération proliférée PBMC en présence de cellules infectées par entérovirus mais pas en réponse à la préparation infectée par maquette En outre, les lymphocytes T proliféraient en présence de IL-, îlot autoantigène IA- aux deux mois SI, et mois SI, et la région immunogène de IA- représentant les acides aminés – à des mois SI , figure Les résultats montrent que la réactivité aux autoantigènes des îlots peut être observée chez ce patient, mais que la réactivité croisée des lymphocytes T avec le GAD et le CVB pC n’a pas été détectée

La prolifération cellulaire de cellules mononucléaires fraîchement isolées après une stimulation in vitro avec l’acide glutamique décarboxylase humaine hGAD, le virus Coxsackie B et la tyrosine phosphatase humaine hIA- dans une étude du diabète sucré de type I induit par les échosomes. Les peptides testés sont indiqués. par le nombre de résidus d’acides aminés provenant des terminaisons aminées de chaque protéine, la prolifération des lymphocytes T a été testée et des mois après l’apparition du diabète sucré de type I *, indice de stimulation de la réponse statistiquement significative, ⩾; **, indice de stimulation ⩾; La prolifération cellulaire de cellules mononucléaires du sang périphérique fraîchement isolées lors d’une stimulation in vitro avec l’acide glutamique décarboxylase humaine hGAD, le virus Coxsackie B et la tyrosine phosphatase humaine hIA- dans une étude sur le diabète sucré de type I induit par un échovirus. les peptides sont indiqués par le nombre de résidus d’acides aminés des terminaisons amino de chaque protéine. La prolifération des lymphocytes T a été testée et des mois après l’apparition du diabète sucré de type I, indice de stimulation de la réponse statistiquement significative; **, indice de stimulation ⩾; pC, protéine C

Discussion

A plusieurs reprises, des antigènes CVB ont été trouvés dans les cellules β après des infections mortelles , indiquant que ces virus infectent les cellules β in vivo D’autres études n’ont pas démontré les antigènes entérovirus dans le pancréas Etudes in vitro rapportées qu’environ% des souches de sérotype CVB ont un tropisme pour le pancréas murin , alors que d’autres serotypes sérotypes CVA et le sérotype CVB détruisent aussi les cellules β de la souris Dans le cas présent, l’EV isolé ne tue pas des cellules ß pancréatiques provenant de donneurs humains normaux in vitro, alors que le sérotype CVB utilisé comme témoin induisait une nécrose massive Bien que nous ne puissions pas tester l’infection des cellules pancréatiques du patient, le virus ne semble pas présenter de tropisme pour les cellules des îlots pancréatiques. l’incapacité d’EV à infecter les cellules β humaines soulève la question de savoir si la destruction des cellules β a été induite par une voie indirecte Les entérovirus peuvent jouer un rôle dans l’initiation de β c La séquence homologue dans CVB pC et GAD est un épitope de cellules T chez la souris diabétique non obèse, et sa présentation est liée à la murine. complexe majeur d’histocompatibilité classe II allèle -Anod, qui confère la susceptibilité à DM D’autres études ont suggéré que cet épitope est reconnu par les cellules T chez les patients atteints de diabète de type I , bien que la réactivité des lymphocytes T à cet épitope a également été trouvé chez les sujets sains L’EV isolée codait pC avec une séquence similaire à celle de GAD, ce qui rend ce cas intéressant pour étudier l’hypothèse de mimétisme moléculaire. En outre, il y avait codage génétique de l’allèle HLA-DQ à haut risque dans ce cas, qui peut se lier aux peptides de mimétisme moléculaire dérivés du pC viral ou du GAD Ainsi, les conditions critiques critiques pour le mimétisme moléculaire ont été rencontrées dans le cas. Cependant, nous n’avons pas détecté d’immu Les lymphocytes T réagissant au GAD ou aux peptides de la région homologue de GAD ou de pC n’ont pas été détectés peu de temps après l’apparition clinique des mois ou des mois plus tard. Les résultats suggèrent que le mimétisme moléculaire avec GAD et CVB pC n’a pas contribué aux dommages aux cellules β et à l’insulino-dépendance subséquente. Il faut noter qu’en testant les lymphocytes du sang périphérique, la fraction des lymphocytes T réactifs aux cellules le pancréas En outre, aux points temporels testés, le nombre de cellules de mémoire T spécifiques de l’antigène pourrait être inférieur au niveau de détection. On peut supposer que l’allèle HLA-DR protecteur, qui a été montré pour lier l’épitope dérivé de GAD représentant des acides aminés – ainsi que , ont rivalisé pour la liaison des peptides de mimétisme moléculaire à DQ et ont fourni un effet protecteur dominant sur la réactivité des cellules T DM induite par le virus de type I Les infections virales ont le potentiel d’induire des réponses pro-inflammatoires avec activation des lymphocytes et des cellules présentatrices d’antigènes professionnelles, qui sont cruciales pour une réponse immunitaire efficace Ce potentiel peut entraîner l’activation de cellules T potentiellement autoréactives. Cette activation occasionnelle peut avoir lieu soit localement dans l’organe cible, soit dans les ganglions lymphatiques drainants . En outre, les cytokines produites localement et d’autres médiateurs inflammatoires sont sélectivement toxiques pour les cellules β, provoquant une mort supplémentaire des spectateurs [ Dans le cas présent, l’absence de pancréatite ou de cytotoxicité des îlots plaiderait plutôt en faveur d’un effet périphérique ou systémique sur les lymphocytes T potentiellement autoréactifs. Ce mécanisme pourrait expliquer la présence de lymphocytes T autoréactifs spécifiques de l’IA chez l’enfant, bien que la réactivité IA peut également être trouvé chez les sujets sains On peut aussi spéculer que vir généralisé L’infection al systémique module systématiquement la réponse immunitaire à une réponse de type cellule Th avec activation du système cellulaire sur les réponses immunitaires humorales Un puissant changement de la réponse immunitaire à l’activation cellulaire peut entraîner une perte de cellules régulatrices et un développement rapide L’absence d’autoanticorps contre les antigènes des îlots malgré la destruction apparente des cellules β, comme indiqué par la perte de la capacité de production d’insuline, est compatible avec un biais préjudiciable aux cellules Th. En conclusion, cette étude rapporte le développement de DM de type I infection systémique par VE En désaccord avec les cas de DM induite par les entérovirus rapportés antérieurement, aucune preuve n’a été trouvée en faveur d’un effet cytolytique direct du virus sur les cellules ß humaines; le patient ne présentait pas de signes indiquant une réaction auto-immune initiée par un mimétisme moléculaire avec l’antigène des cellules β GAD D’autres études devraient examiner la possibilité que les entérovirus comme EV puissent provoquer la destruction des cellules β par une voie indirecte

Remerciements

Nous remercions Manou Batstra Département de pédiatrie, Hôpital universitaire Dijkzigt, Université Erasmus, Rotterdam, Pays-Bas pour la détermination de la présence d’auto-anticorps dans les échantillons de sérum de l’enfant. Nous remercions également Geert Stangé Diabetes Research Centre, Bruxelles, Belgique pour sa contribution à les études in vitro de cellules humaines